CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA PROTEIN
2.4.2 Tủa protein bằng dung môi hữu cơ
Dung mơi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme. Cơng thức biểu diễn mối quan hệ giữa độ hịa tan và hằng số điện môi:
ln (S/Sw) = (A/RT) (1/Dw - 1/D)
Trong đó
S: độ hịa tan của protein trong dung mơi hữu cơ Sw: độ hịa tan của protein trong nước
D: hằng số điện môi của môi trường sau khi đã bổ sung dung môi hữu cơ vào Dw: hằng số điện môi của nước
R: hằng số khí T: nhiệt độ tuyệt đối A: hằng số khí
Cơng thức trên cho thấy: khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hịa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên các
dung môi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tủa chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp (mặc dù một số dung môi như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl Sulfoxide (DMSO) và ethanol có thể được sử dụng ở nồng độ cao.
Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng ethanol và acetone để kết tủa enzyme. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ, cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ. Do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt của các chất như ethanol hoặc acetone, nên bắt buộc khi tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme. Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt các dung mơi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vơ cơ. Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp (-50C). Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme.
Có thể xảy ra hiện tượng biến tính khơng thuận nghịch khi kết tủa bằng dung môi hữu cơ. Nguyên nhân là do khi hằng số điện mơi giảm phân tử protein có thể tự tháo gỡ và tạo thành dạng không hoạt động, trong khi đó các gốc kỵ nước lại tiếp xúc với dung môi. Hiện tượng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độ phịng.
Khi đã có kết tủa, phải tách nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng máy li tâm. Phương pháp này có ưu điểm là khơng cần loại muối, các dung mơi hữu cơ có nhiệt độ bay hơi thấp nên dễ dàng tách khỏi enzyme bằng cách sấy nhẹ nhưng nhược điểm là hay có màu (Lương Đức Phẩm, 2004).