CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA PROTEIN
2.4.1 Sử dụng muối làm tác nhân gây tủa
Đây là cách phổ biến để tủa protein. Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối…Phương pháp kết tủa bằng muối dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein ở một nồng độ muối (tính theo phần trăm nồng độ bão hòa) xác định để loại bỏ một phần protein tạp của dung dịch enzyme (Scopes, 1994). Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out) (Rosenberg, 2005).
Debye – Huckel giải thích giả thuyết salting in ở nồng độ muối thấp như sau: Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích trái dấu. Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm các phân tử protein không mang điện tích, do đó làm tăng tính tan của protein trong dung môi. Giả thuyết của Debye – Huckel cho rằng: tính tan của protein được biểu diễn bằng một hàm logarit, giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch.
Thuật ngữ salting out trong mơi trường có nồng độ muối cao được giải thích bởi Kirkwood. Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm q trình Solvate hóa, giảm tính hịa tan của protein dẫn đến sự tủa.
Ở nồng độ muối cao, độ hịa tan tn theo cơng thức sau của Cohn:
log S = B - KI
Với S: độ hòa tan của protein
B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ)
K: hằng số salting out (phụ thuộc pH, hỗn hợp và lượng muối trong sử dụng) I: cường độ ion của muối.
Hình 12: Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein theo nồng độ muối
Những đường biểu diễn khác nhau tùy theo từng protein khác nhau. Vì thế, khi muốn tách 1 protein từ một hỗn hợp gồm nhiều protein khác nhau, ta có thể lựa chọn nồng độ muối thích hợp sao cho phù hợp nhất với protein mục tiêu.
Độ dốc của đường salting out mô tả ở trên phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ muối, không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống. Hiệu quả tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate. Đối với các cation muối hiệu quả kết tủa tăng dần theo thứ tự: Na+ < K+< NH4+
Trong số các loại muối được sử dụng, người ta nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất. Vì muối (NH4)2SO4 có độ hịa tan cao, rẻ tiền, đồng thời muối (NH4)2SO4 có độ ion hóa cao (độ ion hóa của (NH4)2SO4 nồng độ 1M gấp 3 lần NaCl 1M) (Rosenberg, 2005).Thêm vào đó, kết tủa thu được bằng phương pháp này ổn định, ít bị biến tính nhưng phải tiến hành quá trình loại muối. Ở trạng thái bình thường, các nhóm mang điện tích trên bề mặt enzyme sẽ liên kết với các phân tử nước bao quanh qua liên kết hydro tạo lớp áo nước quanh phân tử. Khi thêm muối ammonium sulfate vào với nồng độ cao, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, các ion này liên kết với các phân tử nước làm cho enzyme mất lớp áo nước, liên kết lại với nhau và tủa xuống (Mukherjee and Banerjee, 2006).