Tủ cấy cũng được tiệt trùng trước khi sử dụng. Sử dụng ống nghiệm để đựng vi khuẩn tăng sinh.
Mục đích của tăng sinh là để cho vi khuẩn phát triển mạnh và tăng nhanh về mật số. Thao tác được thực hiện như sau: sử dụng que cấy đã được hơ đỏ trên ngọn lửa đèn
cồn, để nguội rồi dùng que cấy để lấy vi khuẩn trong đĩa cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch MRS. Các ống nghiệm có chứa vi khuẩn nào cần được ghi số tương ứng với số của vi khuẩn đó ghi trên đĩa.
Sau đó các ống nghiệm được đem đi ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ là 370C trong thời gian là 24 giờ.
(iv) Bảo quản
Đối với chủng vi khuẩn dùng để xác định hoạt tính kháng khuẩn
Chuẩn bị dung dịch MRS cho vào trong ống nghiệm 5ml dung dịch.
Sử dụng que cấy (đã được hơ đỏ, để nguội) lấy vi khuẩn từ ống eppendorf và cho vào dung dịch MRS hoặc NB (Nutrition Broth) đã được chuẩn bị ở trên. Sau mỗi lần lấy
que cấy cần được hơ đỏ, để nguội rồi mới sử dụng tiếp. Sau đó đem đi ủ ở nhiệt độ tối
thích là Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T ở 370C và ở
300C đối với Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157T, Lactobacillus plantarum ATCC 14917T.
Chuẩn bị dung dịch glycerol 30% vô trùng (glycerol 30 : nước 70).
Lấy 500µl của dung dịch vi sinh vật đã được nuôi cấy ở trên vào 500µl của dung dịch glycerol vơ trùng cho vào ống eppendorf (đã được tiệt trùng), lắc đều bằng vortex.
Mỗi loài vi sinh vật thực hiện bốn ống. Sau đó được mang đi trữ đông ở nhiệt độ -
200C hoặc -800C. Tất cả các bước trên đều được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Đối với các chủng LAB thu được
Sau khi được tăng sinh 24 giờ trong tủ ấm, trước khi làm các bước tiếp theo sẽ được trữ lại bảo quản để có thể sử dụng cho các bước tiếp hay các nghiên cứu khác. Các
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 30
lactic trong ống nghiệm sau khi tăng sinh cho vào eppendorf có chứa 500µl glycerol
vơ trùng. Vortex lên để các tế bào vi khuẩn được bao bọc bởi glycerol. Các eppendorf này được đi trữ trong tủ đông ở nhiệt độ -200C.
Các chủng vi khuẩn được sử dụng để kiểm tra đặc tính kháng khuẩn được thể hiện
trong bảng 2.
Bảng 2 : Các dòng vi khuẩn dùng kiểm tra tính kháng khuẩn
TSB (Tryptic Soy Broth) chứa 0,6% YE (Yeast extract) Khi cần sử dụng
Lấy mẫu trữ đông ra, rã đông, lắc đều.
Sau đó, lấy khoảng 100 - 200µl cho vào 5ml mơi trường nuôi cấy lỏng (dung dịch
MRS) đã được tiệt trùng.
Các vi khuẩn trên được đem đi ủ ở nhiệt độ tối thích đối với vi khuẩn lactic thu được,
Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T ở 370C và ở 300C đối với Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157T, Lactobacillus plantarum ATCC 14917T trong tủ ấm với thời gian là 24 giờ. Nhằm giúp cho vi khuẩn hoạt động lại sau thời gian trữ đơng.
Tiếp tục lấy 200µl, cho vào 5ml môi trường nuôi cấy lỏng. Đem ủ ở nhiệt độ tối thích
để cho vi khuẩn tăng sinh khối trở lại. Đối với vi khuẩn lactic thu được thu được thì được ủ ở nhiệt độ là 370C.
Tất cả dụng cụ môi trường làm việc đều được khử trùng trước khi sử dụng.
3.4.2 Thí nghiệm 2: Xác định hoạt tính kháng khuẩn (bacteriocin) của các dòng vi khuẩn vừa tìm ra. khuẩn vừa tìm ra.
Mục đích: Chọn lọc ra các chủng có đặc tính kháng khuẩn.
Vi khuẩn sinh acid lactic Môi trường Nhiệt độ
Lactobacillus plantarum ATCC 14917T Lactobacillus sakei subsp. Sakei JCM 1157T Lactobacillus sakei TISTR 890
MRS MRS MRS 300C 300C 370C
Vi khuẩn gram dương khác Môi trường Nhiệt độ
Bacillus coagulans JCM 2257T TSB-YE(0,6%) hoặc NB
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 31
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện qua các bước chuẩn bị supernatant
(phần nổi bên trên), xác định tính kháng khuẩn. (i) Chuẩn bị supernatant (phần nổi)
Supernatant chính là phần nổi bên trên hay là phần dịch trong không cặn.
Lấy vi khuẩn lactic thu được đã được tăng sinh trong dung dịch MRS cho vào ống ly tâm và mang đi ly tâm, chỉ lấy phần bên trên (supernatant). Ly tâm ở tốc độ là 7500
vòng/phút, nhiệt độ ly tâm là 120C trong thời gian là 10 phút.
Khi ly tâm xong dùng pipetman để lấy phần dịch trong ra, lấy lượng vừa đủ để chỉnh pH (khoảng 1ml). Dùng NaOH 0,1N để đưa pH của dịch supernatant đến 7.
Lấy 1ml dung dịch đã chỉnh pH xong cho vào ống eppendorf. Đem các eppendorf này
đun ở nhiệt độ 1000C trong thời gian là 5 phút. Mục đích của việc đun trên là để trích
ly bacteriocin có trong tế bào vi khuẩn. Chú ý phải ghi thật rõ ký hiệu của từng ống. (ii) Xác định tính kháng khuẩn
Chuẩn bị MRS hay NB chứa 1,5% agar đã được tiệt trùng.
Đổ khoảng 15ml vào đĩa petri, đợi cho khơ.
Sau đó, chuẩn bị 5ml MRS hay NB chứa 1% agar cho vào trong ống nghiệm. Tiếp
theo cho 30ml vi khuẩn chuẩn vào dung dịch agar này, vortex đều hỗn hợp này rồi đổ lớp thứ hai này vào đĩa petri ở trên. Làm khơ bằng khơng khí thổi.
Eppendorf sau khi đun xong tiến hành:
- Lấy 10µl dung dịch trong eppendorf nhỏ lên bề mặt agar đã khô.
- Phần còn lại để qua đêm cho các thành phần trong dịch supernatant sau khi đun ổn định rồi mới lấy 10µl dung dịch này nhỏ lên mơi trường agar khô.
Chú ý cầm pipetman thẳng đứng nhỏ lên bề mặt agar và phải để cho vị trí nhỏ lên khơ hồn tồn, nhằm tránh hiện tượng bị lan.
Ủ qua đêm ở nhiệt độ tối thích 370C đối với khuẩn chuẩn là Lactobacillus sakei TISTR
890, Bacillus coagulans JCM 2257T và ở 300C đối với Lactobacillus sakei subsp.
sakei JCM 1157T, Lactobacillus plantarum ATCC 14917T. Nếu thấy vùng trống (clear zone) nghĩa là có tác dụng kháng khuẩn.
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 32