2.7.1 Tiệt trùng dụng cụ và môi trường làm việc
Khi làm việc với vi sinh vật để tránh những lây nhiễm những vi sinh vật không mong muốn ở môi trường xung quanh, cần phải đảm bảo sao cho môi trường và bề mặt làm việc được vô khuẩn. Cách tiến hành như sau (Lê Văn Việt Mẫn, 2006):
Cửa sổ và cửa ra vào phải được đóng chặt trước thời điểm làm việc.
Sau đó tiến hành bật đèn UV trong thời gian là 15 phút để tiệt trùng khơng khí trong
phịng. Khơng khí chiếu UV sẽ sinh ra ozone, nên khơng khí sẽ có mùi đặc trưng. Bề mặt làm việc có thể được tiệt trùng bằng cách lau với etanol 70%, hay propanol
70%. Khi lau cồn, cần chú ý khơng được bật đèn cồn vì có thể xảy ra hỏa hoạn.
Dụng cụ thủy tinh và kim loại : trước khi tiệt trùng cần được làm sạch và sấy khơ. Sau
đó được gói kín trong giấy, giấy bạc, hay hộp kín để đảm bảo sau khi tiệt trùng dụng cụ
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 23
petri, ống hút cần được bọc kín trong giấy, ống nghiệm cần được đậy nút sau đó gói
giấy mới mang đi tiệt trùng.
Dụng cụ bằng thủy tinh có thể tiệt trùng bằng hai phương pháp: tiệt trùng bằng nhiệt khô và tiệt trùng bằng nhiệt ẩm. Tiệt trùng nhiệt khô bằng cách sấy trong tủ sấy ở nhiệt
độ 170 – 1800C trong thời gian 2,5 giờ hoặc 150 – 1600C trong thời gian 3 giờ đối với dụng cụ có nút bơng. Tiệt trùng bằng nhiệt ẩm thường được thực hiện trong nồi hấp áp lực ở áp suất 0,1MPa tương ứng với nhiệt độ 1210C trong thời gian 20 – 30 phút.
Đối với dụng cụ bằng plastic chịu nhiệt được tiệt trùng bằng nhiệt ẩm trong nồi hấp áp
lực ở áp suất 0,1MPa tương ứng với nhiệt độ 1210C trong thời gian 20 – 30 phút.
2.7.2 Tiệt trùng môi trường nuôi cấy
Khi tiệt trùng trong nồi áp lực chỉ được rót mơi trường đến khoảng 1/3 – 1/2 chiều cao của dụng cụ chứa. Dụng cụ chứa môi trường được đậy bằng nút bông. Nếu là nút nhựa chịu nhiệt cần lưu ý, nút nhựa không được xiết quá chặt vì có thể dẫn đến sự chênh lệch áp suất gây nổ vỡ dụng cụ.
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật thường được tiệt trùng trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 1210C. Thời gian tiệt trùng thường được kéo dài phụ thuộc vào khối lượng và thành
phần dinh dưỡng của môi trường mang đi tiệt trùng. Đối với mơi trường có chứa đường và vitamin được khử trùng 0,05MPa trong 20 – 30 phút, các môi trường khác được khử trùng ở 1210C (0,1 MPa) trong thời gian 15 – 20 phút (Lê Văn Việt Mẫn, 2006).
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 24
CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Phương tiện thí nghiệm
3.1.1 Thời gian, địa điểm
Thời gian thực hiện từ ngày 03/01/2011 đến ngày 22/04/2011.
Địa điểm: Tiến hành thí nghiệm, tại phịng thí nghiệm thuộc Bộ mơn Cơng Nghệ Thực
Phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng – Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Hóa chất sử dụng
- Môi trường MRS - NaOH 0,1N - Cồn 950, cồn 700
3.1.3 Nguyên liệu
Nguyên liệu cải bẹ muối chua được thu mua ở chợ An Nghiệp, quận Ninh Kiều, TP
Cần Thơ.
Nguồn: http//files.myopera.com/minhnhim/blog/DSC07075.JPG
Hình 4: Nguyên liệu cải bẹ muối chua
3.1.4 Thiết bị, dung cụ
- Nồi tiệt trùng áp lực - Tủ cấy vi sinh
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 25
- Máy ly tâm, ống ly tâm - Cân điện tử, vortex
- Đĩa petri, ống nghiệm, eppendorf - Que chang, que cấy, đèn cồn, dao mổ - Bếp điện, bếp gas
- Một số dụng cụ khác cần dùng trong thí nghiệm
3.2 Phương pháp chuẩn bị dịch tăng sinh và môi trường nuôi cấy
3.2.1 Dung dịch pha loãng
Tiến hành cân 8,5g NaCl tinh khiết, cho vào 1 lít nước cất, sau đó khuấy để NaCl hịa tan vào trong nước cất. Khi đã hịa tan hồn tồn mang đi tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong thời gian 15 phút để tiêu diệt vi sinh vật bên trong dung dịch.
3.2.2 Môi trường tăng sinh dung dịch MRS
Tiến hành cân 26,1g MRS pha vào trong 500ml nước cất. Khuấy đều cho MRS hòa tan hết vào trong nước (có thể khuấy bằng cá từ), sau đó mang đi tiệt trùng ở nhiệt độ
1210C trong thời gian 15 phút.
3.2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic
Tiến hành cân 26,1g môi trường MRS, bột agar 7,5g, CaCO3 2,5g pha trong 500ml nước cất. Sau đó khuấy cho hỗn hợp tan hoàn toàn vào trong nước, có thể khuấy bằng
đũa thủy tinh hoặc cá từ. Khuấy dung dịch trên bếp điện hoặc bếp từ để agar được hịa
tan hồn tồn. Có thể đun dung dịch đến sôi để tránh hiện tượng vón cục hay môi
trường không đặc sau khi đổ ra đĩa.
Sau đó mơi trường thạch MRS được mang đi tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong thời gian 15 phút.
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 26
Hình 5: Mơi trường MRS và bột agar
3.3 Nội dung
Nhằm tìm ra dịng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn có mặt trong cải bẹ muối chua, tách riêng dùng vi khuẩn lactic từ quần thể vi khuẩn ban đầu trong nguyên liệu.
3.4 Bố trí thí nghiệm
3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nguyên liệu cải bẹ muối chua muối chua
Mục đích: Tìm ra các dịng vi khuẩn lactic để xác định hoạt tính kháng khuẩn của nó. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành các bước là cấy mẫu, cấy chuyền, tăng sinh và bảo quản vi khuẩn lactic thu được.
(i) Cấy mẫu
Cần tiệt trùng môi trường làm việc (đặc biệt tủ cấy vi sinh) trước khi sử dụng, để tránh sự nhiễm các vi sinh vật lạ vào trong mẫu. Tủ cấy cần được được bật UV trong
khoảng 15 phút để tiệt trùng môi trường bên trong tủ, sau đó được sát trùng lại bằng cồn 700 rồi mới sử dụng.
Môi trường sau khi tiệt trùng được làm nguội và sử dụng. Trong q trình làm nguội mơi trường có thể bị đặc, do agar tạo gel ở nhiệt độ khoảng 38 – 400C nên cần chú ý phải giữ cho môi trường không bị đặc trong suốt q trình đổ đĩa. Nếu mơi trường ban
đầu ở dạng đặc thì phải đun cách thủy để tan ra hoàn toàn rồi mới sử dụng. Sau đó được đổ ra đĩa petri cho mơi trường đặc lại và cấy mẫu.
Đối với nguyên liệu cải bẹ, sau khi mua về cân 10g mẫu trong điều kiện vơ trùng, cắt
nhỏ và cho vào bình tam giác 90ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng. Chuẩn bị trước 5
ống nghiệm thể tích là 10ml có chứa sẵn 9ml nước muối để tiến hành pha loãng mẫu.
Trong q trình chuẩn bị pha lỗng, cần phải lắc đều bình tam giác chứa mẫu, để hệ vi sinh vật bên trong mẫu được phân bố đều vào trong nước muối.
Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân là 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000, 1/10000. Ở bậc pha loãng đầu tiên thì ta tiến hành lấy 1ml dịch mẫu trong
bình tam giác cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối đã được chuẩn bị trước, lắc đều thì ta được bậc pha lỗng là 1/10. Mỗi bậc pha loãng tiếp sau được thực hiện tương
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 27
tự là lấy 1ml dung dịch có độ pha lỗng trước đó cho vào ống nghiệm tương ứng thì sẽ thu được các bậc pha lỗng là 1/100, 1/1000, 1/10000 và 1/10000.
Sau đó, dùng pipetman và đầu tip vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa thạch MRS chứa 0,5% CaCO3. Nhúng đầu que trải thủy tinh vào cồn 700C, hơ trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. Để
đầu que chang (thanh gạt) nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa. Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng que trải lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều
dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần
khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt mơi trường. Sau đó rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa. Mỗi bậc pha loãng được cấy lặp lại hai
lần.
Đĩa được ủ trong tủ ấm chứa CO2 ở nhiệt độ là 370C, thời gian ủ là 48 giờ. Nhưng do nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic rất tương thích với nhiệt độ mơi trường (khoảng 30 – 400C) nên có thể sử dụng bình hút ẩm để ủ. Trong bình có đốt nến nhằm tạo điều kiện yếm khí cho vi khuẩn lactic phát triển. Chỗ tiếp xúc giữa nắp bình và bình sử dụng vazơlin để tránh khơng khí lọt vào.
Sau khi ủ 48h sẽ thấy xuất hiện ở đĩa những khuẩn lạc có dạng hình trịn nhỏ, màu
trắng đục, đồng thời sẽ có một quầng trống xung quanh khuẩn lạc đó thì đó là vi khuẩn lactic. Do vi khuẩn này có khả năng sinh ra acid, acid sẽ tác dụng với CaCO3 đã được pha trong môi trường thạch, nên sẽ làm cho xung quanh khuẩn lạc xuất hiện một vùng trống.
Hình 6: Đĩa sau khi ủ 48 giờ trong điều kiện yếm khí
Ngành Cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nơng nghiệp và SHƯD Trang 28
Các đĩa sau khi xác định có sự hiện diện của LAB (Lactic Acid Bacteria) tiến hành
cấy chuyền để thu được dòng vi khuẩn này mà khơng có sự hiện diện của các vi khuẩn khác.
Trước tiên, cần tiệt trùng môi trường làm việc theo các bước như cấy chuyền, sau đó
mới lấy mơi trường đã được nấu chảy đổ ra đĩa petri. Khi môi trường trong đĩa đã đặc và khô, ta tiến hành chia đĩa ra làm tám hoặc làm bốn để có thể tiết kiệm được đĩa,
cũng như mơi trường ni cấy.
Tiếp đó dùng que cấy phải được hơ đỏ, làm nguội và lấy một vòng que cấy đầy hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập. Nghiêng hé mở nắp đĩa petri ra dùng que cấy zíc zắc lên các phần mơi trường đã được chia.
Que cấy phải được hơ đỏ, làm nguội mới lấy hỗn hợp vi sinh vật tiếp theo cấy lên các phần môi trường kế tiếp. Thực hiện tương tự với các đĩa cịn lại. Mơi trường sử dụng ở
đây là MRS có 1,5% bột agar và 0,5% CaCO3.
Đĩa này cũng được ủ ở nhiệt độ mơi trường, có trong bình nến (có thể sử dụng tủ ấm) để tao sự yếm khí, trong thời gian là 24giờ. Nhằm mục đích tách LAB ra khỏi ra khỏi
hỗn hợp vi sinh vật trong môi trường cấy mẫu ban đầu.
Hình 7: Đĩa sau khi được cấy chuyền sau khi ủ 24 giờ
(iii) Tăng sinh
Sau thời gian ủ là 24 giờ lấy đĩa ra xem, những khuẩn lạc nào có xuất hiện những
vùng trống (clear zone) xung quanh thì lấy khuẩn lạc đó mang đi tăng sinh trong dung dịch MRS. Quá trình tăng sinh cũng được thực hiện trong tủ cấy vi sinh.
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 29
Hình 8: Ống nghiệm sau khi tăng sinh
Tủ cấy cũng được tiệt trùng trước khi sử dụng. Sử dụng ống nghiệm để đựng vi khuẩn tăng sinh.
Mục đích của tăng sinh là để cho vi khuẩn phát triển mạnh và tăng nhanh về mật số. Thao tác được thực hiện như sau: sử dụng que cấy đã được hơ đỏ trên ngọn lửa đèn
cồn, để nguội rồi dùng que cấy để lấy vi khuẩn trong đĩa cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch MRS. Các ống nghiệm có chứa vi khuẩn nào cần được ghi số tương ứng với số của vi khuẩn đó ghi trên đĩa.
Sau đó các ống nghiệm được đem đi ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ là 370C trong thời gian là 24 giờ.
(iv) Bảo quản
Đối với chủng vi khuẩn dùng để xác định hoạt tính kháng khuẩn
Chuẩn bị dung dịch MRS cho vào trong ống nghiệm 5ml dung dịch.
Sử dụng que cấy (đã được hơ đỏ, để nguội) lấy vi khuẩn từ ống eppendorf và cho vào dung dịch MRS hoặc NB (Nutrition Broth) đã được chuẩn bị ở trên. Sau mỗi lần lấy
que cấy cần được hơ đỏ, để nguội rồi mới sử dụng tiếp. Sau đó đem đi ủ ở nhiệt độ tối
thích là Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T ở 370C và ở
300C đối với Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157T, Lactobacillus plantarum ATCC 14917T.
Chuẩn bị dung dịch glycerol 30% vô trùng (glycerol 30 : nước 70).
Lấy 500µl của dung dịch vi sinh vật đã được ni cấy ở trên vào 500µl của dung dịch glycerol vô trùng cho vào ống eppendorf (đã được tiệt trùng), lắc đều bằng vortex.
Mỗi loài vi sinh vật thực hiện bốn ống. Sau đó được mang đi trữ đông ở nhiệt độ -
200C hoặc -800C. Tất cả các bước trên đều được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Đối với các chủng LAB thu được
Sau khi được tăng sinh 24 giờ trong tủ ấm, trước khi làm các bước tiếp theo sẽ được trữ lại bảo quản để có thể sử dụng cho các bước tiếp hay các nghiên cứu khác. Các
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 30
lactic trong ống nghiệm sau khi tăng sinh cho vào eppendorf có chứa 500µl glycerol
vơ trùng. Vortex lên để các tế bào vi khuẩn được bao bọc bởi glycerol. Các eppendorf này được đi trữ trong tủ đông ở nhiệt độ -200C.
Các chủng vi khuẩn được sử dụng để kiểm tra đặc tính kháng khuẩn được thể hiện
trong bảng 2.
Bảng 2 : Các dịng vi khuẩn dùng kiểm tra tính kháng khuẩn
TSB (Tryptic Soy Broth) chứa 0,6% YE (Yeast extract) Khi cần sử dụng
Lấy mẫu trữ đông ra, rã đơng, lắc đều.
Sau đó, lấy khoảng 100 - 200µl cho vào 5ml môi trường nuôi cấy lỏng (dung dịch
MRS) đã được tiệt trùng.
Các vi khuẩn trên được đem đi ủ ở nhiệt độ tối thích đối với vi khuẩn lactic thu được,
Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T ở 370C và ở 300C đối với Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157T, Lactobacillus plantarum ATCC 14917T trong tủ ấm với thời gian là 24 giờ. Nhằm giúp cho vi khuẩn hoạt động lại sau thời gian trữ đông.
Tiếp tục lấy 200µl, cho vào 5ml mơi trường ni cấy lỏng. Đem ủ ở nhiệt độ tối thích
để cho vi khuẩn tăng sinh khối trở lại. Đối với vi khuẩn lactic thu được thu được thì được ủ ở nhiệt độ là 370C.
Tất cả dụng cụ môi trường làm việc đều được khử trùng trước khi sử dụng.
3.4.2 Thí nghiệm 2: Xác định hoạt tính kháng khuẩn (bacteriocin) của các dịng vi khuẩn vừa tìm ra. khuẩn vừa tìm ra.
Mục đích: Chọn lọc ra các chủng có đặc tính kháng khuẩn.
Vi khuẩn sinh acid lactic Môi trường Nhiệt độ
Lactobacillus plantarum ATCC 14917T Lactobacillus sakei subsp. Sakei JCM 1157T Lactobacillus sakei TISTR 890
MRS MRS MRS 300C 300C 370C
Vi khuẩn gram dương khác Môi trường Nhiệt độ
Bacillus coagulans JCM 2257T TSB-YE(0,6%) hoặc NB
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 31
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện qua các bước chuẩn bị supernatant
(phần nổi bên trên), xác định tính kháng khuẩn. (i) Chuẩn bị supernatant (phần nổi)
Supernatant chính là phần nổi bên trên hay là phần dịch trong không cặn.
Lấy vi khuẩn lactic thu được đã được tăng sinh trong dung dịch MRS cho vào ống ly tâm và mang đi ly tâm, chỉ lấy phần bên trên (supernatant). Ly tâm ở tốc độ là 7500
vòng/phút, nhiệt độ ly tâm là 120C trong thời gian là 10 phút.
Khi ly tâm xong dùng pipetman để lấy phần dịch trong ra, lấy lượng vừa đủ để chỉnh pH (khoảng 1ml). Dùng NaOH 0,1N để đưa pH của dịch supernatant đến 7.
Lấy 1ml dung dịch đã chỉnh pH xong cho vào ống eppendorf. Đem các eppendorf này
đun ở nhiệt độ 1000C trong thời gian là 5 phút. Mục đích của việc đun trên là để trích
ly bacteriocin có trong tế bào vi khuẩn. Chú ý phải ghi thật rõ ký hiệu của từng ống. (ii) Xác định tính kháng khuẩn
Chuẩn bị MRS hay NB chứa 1,5% agar đã được tiệt trùng.