3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nguyên liệu cải bẹ muối chua muối chua
Mục đích: Tìm ra các dịng vi khuẩn lactic để xác định hoạt tính kháng khuẩn của nó. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành các bước là cấy mẫu, cấy chuyền, tăng sinh và bảo quản vi khuẩn lactic thu được.
(i) Cấy mẫu
Cần tiệt trùng môi trường làm việc (đặc biệt tủ cấy vi sinh) trước khi sử dụng, để tránh sự nhiễm các vi sinh vật lạ vào trong mẫu. Tủ cấy cần được được bật UV trong
khoảng 15 phút để tiệt trùng mơi trường bên trong tủ, sau đó được sát trùng lại bằng cồn 700 rồi mới sử dụng.
Môi trường sau khi tiệt trùng được làm nguội và sử dụng. Trong q trình làm nguội mơi trường có thể bị đặc, do agar tạo gel ở nhiệt độ khoảng 38 – 400C nên cần chú ý phải giữ cho mơi trường khơng bị đặc trong suốt q trình đổ đĩa. Nếu môi trường ban
đầu ở dạng đặc thì phải đun cách thủy để tan ra hoàn toàn rồi mới sử dụng. Sau đó được đổ ra đĩa petri cho môi trường đặc lại và cấy mẫu.
Đối với nguyên liệu cải bẹ, sau khi mua về cân 10g mẫu trong điều kiện vô trùng, cắt
nhỏ và cho vào bình tam giác 90ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng. Chuẩn bị trước 5
ống nghiệm thể tích là 10ml có chứa sẵn 9ml nước muối để tiến hành pha loãng mẫu.
Trong q trình chuẩn bị pha lỗng, cần phải lắc đều bình tam giác chứa mẫu, để hệ vi sinh vật bên trong mẫu được phân bố đều vào trong nước muối.
Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân là 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000, 1/10000. Ở bậc pha loãng đầu tiên thì ta tiến hành lấy 1ml dịch mẫu trong
bình tam giác cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối đã được chuẩn bị trước, lắc đều thì ta được bậc pha lỗng là 1/10. Mỗi bậc pha lỗng tiếp sau được thực hiện tương
Ngành Cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 27
tự là lấy 1ml dung dịch có độ pha lỗng trước đó cho vào ống nghiệm tương ứng thì sẽ thu được các bậc pha lỗng là 1/100, 1/1000, 1/10000 và 1/10000.
Sau đó, dùng pipetman và đầu tip vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa thạch MRS chứa 0,5% CaCO3. Nhúng đầu que trải thủy tinh vào cồn 700C, hơ trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. Để
đầu que chang (thanh gạt) nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa. Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng que trải lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều
dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần
khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt mơi trường. Sau đó rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa. Mỗi bậc pha loãng được cấy lặp lại hai
lần.
Đĩa được ủ trong tủ ấm chứa CO2 ở nhiệt độ là 370C, thời gian ủ là 48 giờ. Nhưng do nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic rất tương thích với nhiệt độ mơi trường (khoảng 30 – 400C) nên có thể sử dụng bình hút ẩm để ủ. Trong bình có đốt nến nhằm tạo điều kiện yếm khí cho vi khuẩn lactic phát triển. Chỗ tiếp xúc giữa nắp bình và bình sử dụng vazơlin để tránh khơng khí lọt vào.
Sau khi ủ 48h sẽ thấy xuất hiện ở đĩa những khuẩn lạc có dạng hình trịn nhỏ, màu
trắng đục, đồng thời sẽ có một quầng trống xung quanh khuẩn lạc đó thì đó là vi khuẩn lactic. Do vi khuẩn này có khả năng sinh ra acid, acid sẽ tác dụng với CaCO3 đã được pha trong môi trường thạch, nên sẽ làm cho xung quanh khuẩn lạc xuất hiện một vùng trống.
Hình 6: Đĩa sau khi ủ 48 giờ trong điều kiện yếm khí
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 28
Các đĩa sau khi xác định có sự hiện diện của LAB (Lactic Acid Bacteria) tiến hành
cấy chuyền để thu được dịng vi khuẩn này mà khơng có sự hiện diện của các vi khuẩn khác.
Trước tiên, cần tiệt trùng môi trường làm việc theo các bước như cấy chuyền, sau đó
mới lấy mơi trường đã được nấu chảy đổ ra đĩa petri. Khi môi trường trong đĩa đã đặc và khô, ta tiến hành chia đĩa ra làm tám hoặc làm bốn để có thể tiết kiệm được đĩa,
cũng như mơi trường ni cấy.
Tiếp đó dùng que cấy phải được hơ đỏ, làm nguội và lấy một vòng que cấy đầy hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập. Nghiêng hé mở nắp đĩa petri ra dùng que cấy zíc zắc lên các phần mơi trường đã được chia.
Que cấy phải được hơ đỏ, làm nguội mới lấy hỗn hợp vi sinh vật tiếp theo cấy lên các phần môi trường kế tiếp. Thực hiện tương tự với các đĩa cịn lại. Mơi trường sử dụng ở
đây là MRS có 1,5% bột agar và 0,5% CaCO3.
Đĩa này cũng được ủ ở nhiệt độ môi trường, có trong bình nến (có thể sử dụng tủ ấm) để tao sự yếm khí, trong thời gian là 24giờ. Nhằm mục đích tách LAB ra khỏi ra khỏi
hỗn hợp vi sinh vật trong môi trường cấy mẫu ban đầu.
Hình 7: Đĩa sau khi được cấy chuyền sau khi ủ 24 giờ
(iii) Tăng sinh
Sau thời gian ủ là 24 giờ lấy đĩa ra xem, những khuẩn lạc nào có xuất hiện những
vùng trống (clear zone) xung quanh thì lấy khuẩn lạc đó mang đi tăng sinh trong dung dịch MRS. Quá trình tăng sinh cũng được thực hiện trong tủ cấy vi sinh.
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 29
Hình 8: Ống nghiệm sau khi tăng sinh
Tủ cấy cũng được tiệt trùng trước khi sử dụng. Sử dụng ống nghiệm để đựng vi khuẩn tăng sinh.
Mục đích của tăng sinh là để cho vi khuẩn phát triển mạnh và tăng nhanh về mật số. Thao tác được thực hiện như sau: sử dụng que cấy đã được hơ đỏ trên ngọn lửa đèn
cồn, để nguội rồi dùng que cấy để lấy vi khuẩn trong đĩa cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch MRS. Các ống nghiệm có chứa vi khuẩn nào cần được ghi số tương ứng với số của vi khuẩn đó ghi trên đĩa.
Sau đó các ống nghiệm được đem đi ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ là 370C trong thời gian là 24 giờ.
(iv) Bảo quản
Đối với chủng vi khuẩn dùng để xác định hoạt tính kháng khuẩn
Chuẩn bị dung dịch MRS cho vào trong ống nghiệm 5ml dung dịch.
Sử dụng que cấy (đã được hơ đỏ, để nguội) lấy vi khuẩn từ ống eppendorf và cho vào dung dịch MRS hoặc NB (Nutrition Broth) đã được chuẩn bị ở trên. Sau mỗi lần lấy
que cấy cần được hơ đỏ, để nguội rồi mới sử dụng tiếp. Sau đó đem đi ủ ở nhiệt độ tối
thích là Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T ở 370C và ở
300C đối với Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157T, Lactobacillus plantarum ATCC 14917T.
Chuẩn bị dung dịch glycerol 30% vô trùng (glycerol 30 : nước 70).
Lấy 500µl của dung dịch vi sinh vật đã được ni cấy ở trên vào 500µl của dung dịch glycerol vô trùng cho vào ống eppendorf (đã được tiệt trùng), lắc đều bằng vortex.
Mỗi loài vi sinh vật thực hiện bốn ống. Sau đó được mang đi trữ đơng ở nhiệt độ -
200C hoặc -800C. Tất cả các bước trên đều được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Đối với các chủng LAB thu được
Sau khi được tăng sinh 24 giờ trong tủ ấm, trước khi làm các bước tiếp theo sẽ được trữ lại bảo quản để có thể sử dụng cho các bước tiếp hay các nghiên cứu khác. Các
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 30
lactic trong ống nghiệm sau khi tăng sinh cho vào eppendorf có chứa 500µl glycerol
vơ trùng. Vortex lên để các tế bào vi khuẩn được bao bọc bởi glycerol. Các eppendorf này được đi trữ trong tủ đông ở nhiệt độ -200C.
Các chủng vi khuẩn được sử dụng để kiểm tra đặc tính kháng khuẩn được thể hiện
trong bảng 2.
Bảng 2 : Các dịng vi khuẩn dùng kiểm tra tính kháng khuẩn
TSB (Tryptic Soy Broth) chứa 0,6% YE (Yeast extract) Khi cần sử dụng
Lấy mẫu trữ đông ra, rã đông, lắc đều.
Sau đó, lấy khoảng 100 - 200µl cho vào 5ml môi trường nuôi cấy lỏng (dung dịch
MRS) đã được tiệt trùng.
Các vi khuẩn trên được đem đi ủ ở nhiệt độ tối thích đối với vi khuẩn lactic thu được,
Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T ở 370C và ở 300C đối với Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157T, Lactobacillus plantarum ATCC 14917T trong tủ ấm với thời gian là 24 giờ. Nhằm giúp cho vi khuẩn hoạt động lại sau thời gian trữ đơng.
Tiếp tục lấy 200µl, cho vào 5ml môi trường nuôi cấy lỏng. Đem ủ ở nhiệt độ tối thích
để cho vi khuẩn tăng sinh khối trở lại. Đối với vi khuẩn lactic thu được thu được thì được ủ ở nhiệt độ là 370C.
Tất cả dụng cụ môi trường làm việc đều được khử trùng trước khi sử dụng.
3.4.2 Thí nghiệm 2: Xác định hoạt tính kháng khuẩn (bacteriocin) của các dịng vi khuẩn vừa tìm ra. khuẩn vừa tìm ra.
Mục đích: Chọn lọc ra các chủng có đặc tính kháng khuẩn.
Vi khuẩn sinh acid lactic Môi trường Nhiệt độ
Lactobacillus plantarum ATCC 14917T Lactobacillus sakei subsp. Sakei JCM 1157T Lactobacillus sakei TISTR 890
MRS MRS MRS 300C 300C 370C
Vi khuẩn gram dương khác Môi trường Nhiệt độ
Bacillus coagulans JCM 2257T TSB-YE(0,6%) hoặc NB
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 31
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện qua các bước chuẩn bị supernatant
(phần nổi bên trên), xác định tính kháng khuẩn. (i) Chuẩn bị supernatant (phần nổi)
Supernatant chính là phần nổi bên trên hay là phần dịch trong không cặn.
Lấy vi khuẩn lactic thu được đã được tăng sinh trong dung dịch MRS cho vào ống ly tâm và mang đi ly tâm, chỉ lấy phần bên trên (supernatant). Ly tâm ở tốc độ là 7500
vòng/phút, nhiệt độ ly tâm là 120C trong thời gian là 10 phút.
Khi ly tâm xong dùng pipetman để lấy phần dịch trong ra, lấy lượng vừa đủ để chỉnh pH (khoảng 1ml). Dùng NaOH 0,1N để đưa pH của dịch supernatant đến 7.
Lấy 1ml dung dịch đã chỉnh pH xong cho vào ống eppendorf. Đem các eppendorf này
đun ở nhiệt độ 1000C trong thời gian là 5 phút. Mục đích của việc đun trên là để trích
ly bacteriocin có trong tế bào vi khuẩn. Chú ý phải ghi thật rõ ký hiệu của từng ống. (ii) Xác định tính kháng khuẩn
Chuẩn bị MRS hay NB chứa 1,5% agar đã được tiệt trùng.
Đổ khoảng 15ml vào đĩa petri, đợi cho khơ.
Sau đó, chuẩn bị 5ml MRS hay NB chứa 1% agar cho vào trong ống nghiệm. Tiếp
theo cho 30ml vi khuẩn chuẩn vào dung dịch agar này, vortex đều hỗn hợp này rồi đổ lớp thứ hai này vào đĩa petri ở trên. Làm khơ bằng khơng khí thổi.
Eppendorf sau khi đun xong tiến hành:
- Lấy 10µl dung dịch trong eppendorf nhỏ lên bề mặt agar đã khơ.
- Phần cịn lại để qua đêm cho các thành phần trong dịch supernatant sau khi đun ổn định rồi mới lấy 10µl dung dịch này nhỏ lên môi trường agar khô.
Chú ý cầm pipetman thẳng đứng nhỏ lên bề mặt agar và phải để cho vị trí nhỏ lên khơ hồn tồn, nhằm tránh hiện tượng bị lan.
Ủ qua đêm ở nhiệt độ tối thích 370C đối với khuẩn chuẩn là Lactobacillus sakei TISTR
890, Bacillus coagulans JCM 2257T và ở 300C đối với Lactobacillus sakei subsp.
sakei JCM 1157T, Lactobacillus plantarum ATCC 14917T. Nếu thấy vùng trống (clear zone) nghĩa là có tác dụng kháng khuẩn.
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 32
Hình 9: Chủng vi khuẩn lactic sau khi thử tính kháng khuẩn
Chủng Lactobacillus sakei TISTR 890
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 33
CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Từ nguyên liệu cải bẹ muối chua tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS. Kết quả thu được như sau:
Thu được 22 dòng vi khuẩn lactic được chọn ngẫu nhiên từ nguyên liệu cải bẹ muối
chua ban đầu, mỗi khuẩn lạc của chủng có kích thước lớn bé khác nhau. Sau đây là đặc điểm hình dạng của chủng thu được bảng mô tả sau.
Bảng 3: Đặc điểm hình dạng của 22 chủng khuẩn lactic tuyển chọn được
Chủng vi khuẩn Hình dạng khuẩn lạc Hoạt tính ức chế vi khuẩn
H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16 H17 H18 H19 H20 H21 H22 Tròn, trắng, nhỏ, hơi lồi Tròn, trắng đục, nhỏ Tròn, trắng, lớn Tròn, trắng sữa, vừa Tròn, trắng, nhỏ Tròn, đục, nhỏ, bóng Trịn, đục, vừa, lồi Trịn, vàng kem, nhỏ Tròn, trắng, vừa Tròn, trắng sữa, lớn, lồi Tròn, trắng đục, vừa Tròn, trắng, nhỏ Tròn, trắng, lớn Tròn, trắng đục ngà, nhỏ Tròn, trắng đục, lớn, lồi Tròn, trắng, vừa, hơi lồi Tròn, trắng sữa, nhỏ Tròn, trắng, vừa Tròn, trắng sữa, nhỏ Tròn, vàng kem, nhỏ Tròn, trắng đục, lớn Tròn, trắng, vừa II, IV - I, II, III, IV I, II, III, IV - - I, II, III, IV - - II, III, IV - - - - - - - - - - - -
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 34
Với:
I: Lactobacillus plantarum ATCC 14917T III: Lactobacillus sakei TISTR 890 II: Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157T IV: Bacillus coagulans JCM 2257
Qua thống kê thu được từ bảng 3, có kết quả sau:
- Phần supernatant sau khi đun nóng nhỏ liền lên bề mặt agar khô không cho kết quả như mong muốn. Do thành phần bacteriocin bên trong dịch này chưa được kích hoạt
và ổn định nên khơng thấy được đặc tính kháng khuẩn của nó.
- Phần supernatant để ổn định qua đêm rồi nhỏ: Kết quả thu được gồm có các chủng
H1, H3, H4, H7, H10 có hoạt tính kháng khuẩn.
Chủng số H3, H4, H7 có thể kháng được cả bốn dòng khuẩn chuẩn là Lactobacillus
sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T, Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157T và Lactobacillus plantarum ATCC 14917T.
Chủng số H10 kháng được ba dòng Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus
coagulans JCM 2257T, Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157T.
Chủng số H1 kháng hai dòng Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 35
Hình 10: Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn lactic
Trong nguyên liệu thu được 22 chủng LA, trong đó chỉ có 5 chủng là có khả năng tiết ra hoạt tính kháng khuẩn. Mỗi chủng này lại có những hoạt tính và tính chất kháng khuẩn khác nhau.
Từ 5 chủng thì chỉ có chủng H3, H4, H7 là kháng được cả bốn dòng khuẩn chuẩn,
chủng H10 kháng được ba dòng, chủng H1 chỉ kháng được hai dịng, ngun nhân có thể là do hoạt tính kháng khuẩn (bacteriocin) của H3, H4, H7 thì mạnh, ổn định và được tiết ra là nhiều hơn nên kháng được các chủng vi khuẩn dùng để thử. Các chủng
còn lại là H10, H1 thì do chất kháng khuẩn tiết ra ít hơn hoạt tính kháng khuẩn yếu nên tính kháng khơng được thể hiện trên nhiều dịng vi khuẩn.
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 36
CHƯƠNG VI KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 6.1 Kết luận
Theo kết quả nghiên cứu ta có được kết luận như sau:
Phân lập và tuyển chọn được 22 chủng vi khuẩn lactic từ nguyên liệu ban đầu.
Đặc tính kháng khuẩn được thể hiện rõ nhất trên môi trường thạch MRS khi LAB thu được (sau khi đun) để ủ qua đêm.
Trong nguyên liệu cải bẹ muối chua có sự hiện diện của dịng vi khuẩn có đặc tính
kháng khuẩn. Có 5 chủng có thể tiết ra chất kháng khuẩn (hay kháng sinh sinh học) là bacteriocin có thể thay thể cho thuốc kháng sinh hay chất bảo quản hóa học mà khơng làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
6.2 Đề nghị
Do thời gian nghiên cứu bị giới hạn nên không đề tài không thể tiến sâu hơn được về
đặc tính và tính chất của các dòng vi khuẩn tiết ra chất kháng sinh này. Vì vậy nếu có