CHƯƠNG 3 : PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.2 Phương pháp thí nghiệm
3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nem chua
•••• Mục đích :
Vi sinh vật trong nem chua, ngồi vi khuẩn lactic cịn có nhiều chủng loại khác nhau. Chọn những khuẩn lạc mang đặc điểm cơ bản của vi khuẩn lactic rồi tiến hành cấy
Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011 Trường Đại Học Cần Thơ
Sơ đồ thí nghiệm :
• Tiến hành
- Nguyên liệu :
Nem dùng làm thí nghiệm phải cịn thời hạn sử dụng, phải đảm bảo được giữ ở nhiệt
độ thấp trong suốt thời gian bảo quản. Nếu lập lại quá trình phân lập phải sử dung mẫu
nem cịn mới, không sử dụng trên cùng mẫu nem đã dùng cho phân lập lần trước đó để tránh hiện tượng tạp nhiễm.
- Cân mẫu :
Cân 10g mẫu để tiến hành pha lỗng. Q trình cân mẫu phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Đĩa chứa mẫu phải qua tiệt trùng, dao cắt mẫu phải được hơ nóng
Nem chua
Cân mẫu
Pha lỗng mẫu
Cấy mẫu lên mơi trường phân lập Ủ mẫu Chọn khuẩn lạc đặc trưng Cấy chuyền Ủ mẫu Chọn chủng vi khuẩn lactic thuần nhất
Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011 Trường Đại Học Cần Thơ
trên ngọn lữa đèn cồn rồi để nguội trong vài giây. Khi cân, không để mẫu phân tích
dính vào bao bì bên ngồi để tránh hiện tượng tạp nhiễm. - Pha loãng mẫu :
Pha loãng mẫu ở các nồng độ khác nhau nhằm tránh hiện tượng các khuẩn lạc phát triển dày khít trên mặt thạch, khơng phân lập được. Dùng nước muối sinh lý 0,85% (đã được tiệt trùng) để pha loãng. Trong nước muối sinh lý, tế bào vi sinh vật vẫn có thể thực hiện các q trình trao đổi chất bình thường.
Cho 10g mẫu (đã được sắt nhỏ) vào bình tam giác 100 ml. Dùng ống đong đong 90 mL nước muối sinh lý rồi cho vào bình chứa mẫu. Ta được mẫu pha lỗng ở nồng độ 10-1. Lắc đều mẫu và để khoảng 10 phút cho mẫu hoà tan đều. Dùng pipet hút 9 ml nước muối sinh lý cho vào ống nghiệm có thể tích 10 ml, thực hịên trên 4 ống để có
được nồng độ pha loãng đến 10-5. Dùng micropipet hút 1ml dung dịch chứa mẫu trong bình tam giác cho vào ống nghiệm thứ nhất, lắc đều ta có được mẫu pha loãng ở nồng
độ 10-2. Từ ống nghiệm này, thực hiện các thao tác tương tự để pha lỗng đến nồng
độ 10-5. Q trình phải được thực hiện gần ngọn lữa đèn cồn. - Pha môi trường :
Thành phần môi trường gồm : MRS, 1,5% Agar, 0,5% CaCO3 MRS 27,5 g
Agar 7.5 g CaCO3 2.5 g Nước cất 500 ml
Hoà tan đều, gia nhiệt rồi thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. - Cấy mẫu:
Mẫu được cấy theo phương pháp thông thường. Lắc nhẹ và đều ống nghiệm, dùng micropipet hút 100 µl mẫu đã pha lỗng cho vào bề mặt mơi trường trong đĩa petri, dùng que tam giác chang đều mẫu trên mặt đĩa. Mỗi nồng độ lập lại trên 2 đĩa. - Ủ mẫu :
Mẫu được ủ trong tủ ủ CO2 để tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic phát triển. Nhưng vì trong thời gian này tủ ủ CO2 bị hư nên chúng tôi ủ mẫu trong bình hút ẩm (đã được khử trùng). Đặt mẫu vào bình, đốt nến, bơi vazơlin lên thành bình rồi đậy kín nắp. Ủ ở nhiệt độ phịng (300C) trong 24 ÷ 48 giờ, ghi nhận kết quả.
Tồn bộ thao tác của quá trình được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Các dụng cụ, thiết bị sử dụng đều được tiệt trùng.
Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011 Trường Đại Học Cần Thơ
- Chọn khuẩn lạc:
Từ những khuẩn lạc trên môi trường phân lập, chúng tôi chọn những khuẩn lạc đặc trưng, tách rời để tiến hành cấy chuyền. Môi trường dùng cho cấy chuyền hoàn toàn tương tự như phân lập với đầy đủ thành phần dinh dưỡng cho sự phát triển của vi khuẩn lactic. Các khuẩn lạc lactic được nhận diện là những khuẩn lạc mà xung quanh chúng màu trắng đục của CaCO3 khơng cịn nữa do tạo thành lactac canxi trong phản
ứng giữa chúng với axit lactic.
- Cấy chuyền:
Đĩa petri cấy chuyền được kẻ phía ngồi thành tám phần khác nhau để đảm bảo mỗi
khuẩn lạc thu được được tách riêng lẽ.
Dùng que cấy đầu trịn đốt nóng trên ngọn lữa đèn cồn, để nguội trong vài giây. Đầu que cấy chạm nhẹ vào khuẩn lạc rồi chuyển sang đĩa cấy chuyền, trượt nhẹ đầu que lên góc phần tám thứ nhất trên mặt thạch theo hình ziczăc. Các khuẩn lạc sau đó cũng thực hiện tương tự. Đầu que cấy phải được đốt nóng trên ngọn lữa đèn cồn sau mỗi lần thao tác trên các khuẩn lạc khác nhau.
- Ủ mẫu :
Mẫu sau khi cấy chuyền được ủ ở nhiệt độ phịng, trong bình hút ẩm được đốt nến để tạo mơi trường yếm khí. Thời gian ủ 24 giờ.
- Thu nhận kết quả :
Chọn những chủng lactic phát triển mạnh và đồng đều nhất.