CHƯƠNG 3 : PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.2 Phương pháp thí nghiệm
3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Thử đặc tính kháng khuẩn của các chủng LAB thu được từ
nem chua
•••• Mục đích:
Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011 Trường Đại Học Cần Thơ
Sơ đồ thí nghiệm :
•••• Tiến hành
- Tăng sinh :
Khuẩn lạc thu được sau khi cấy chuyền được tăng sinh trong môi trường MRS để tế bào vi sinh vật phát triển đến số lượng thích hợp.
Dùng pipet hút 5ml dung dịch (đã vô trùng) MRS cho vào mỗi ống nghiệm. Dùng que cấy gạt nhẹ lên những chủng LAB được chọn. Mỗi chủng khác nhau cho vào một ống nghiệm khác nhau. Các ống nghiệm này được đánh số để tránh nhầm lẫn và thuận tiện cho việc nghiên cứu về sau.
Các chủng LAB tăng sinh được ủ ở nhiệt độ 370C từ 16 ÷ 18 giờ nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển.
- Trữ giống :
Hồ với mơi trường 2 LAB thu được
Tăng sinh Ly tâm Vi khuẩn chuẩn Tăng sinh Chỉnh pH Đun sôi Môi trường 1 Đỗ đĩa petri lần 1 Đỗ đĩa petri lần 2 Cấy mẫu Trữ giống Ủ Ghi nhận kết quả
Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011 Trường Đại Học Cần Thơ
Sau khi tăng sinh, giống được trữ đông một phần để phục vụ việc nghiên cứu về sau. Dùng micropipet hút 500 µl dung dịch glycerol 30% (đã được tiệt trùng) cho vào mỗi
ống Eppendorf khác nhau, lấy 500 µl dung dịch chủng LAB đã tăng sinh cho vào các Eppendorf này, mỗi chủng khác nhau được cho vào mỗi ống khác nhau và được đánh số tương ứng với số trên ống tăng sinh. Dùng vortex lắc đều các Eppendorf rồi trữ
đông ở -200C. - Ly tâm :
Trong thời gian tăng sinh, do vi khuẩn lactic liên tục sinh trưởng và phát triển, tạo ra nhiều tế bào mới, do đó có khơng ít tế bào già và chết đi nên chúng tôi tiến hành ly tâm cao tốc để loại bỏ phần tế bào già và chết này để thu lấy phần dịch trong mang
đầy đủ những đặc tính của chủng. Ngồi ra việc ly tâm cịn giúp loại bỏ hồn tồn
thành phần bã trong môi trường MRS. Chế độ ly tâm :
Nhiệt độ ly tâm là 100C Thời gian ly tâm 10 phút
Tốc độ vòng quay 7500 vòng/phút - Chỉnh pH :
Môi trường tăng sinh MRS ban đầu có giá trị pH 6,3. Q trình phát triển sinh lý của vi khuẩn lactic tạo ra axit lactic làm pH của mơi trường giảm xuống 3,4 ÷ 3,5. Dùng NaOH 0,1N để chỉnh pH về 7. Nhiều nghiên cứu cho thấy ở pH này bacteriocin hoạt
động tốt.
- Đun sôi :
Các chủng LAB sau khi đưa về pH trung tính, lấy mỗi chủng 1ml cho vào mỗi
Eppendorf khác nhau rồi được đun sôi ở 1000C trong 6 phút, sau đó tiến hành thử đặc tính kháng khuẩn. Khi các tế bào vi khuẩn lactic bị chết do đun sơi, nó sẽ tiết ra những hợp chất peptit có khả năng kháng khuẩn nếu chủng lactic nào có được đặc tính này. - Vi khuẩn chuẩn :
Vi khuẩn chuẩn dùng thử nghiệm được lấy từ một trung tâm nghiên cứu tại Thái Lan gồm :
Lactobacillus plantarum ATCC 14917T (nhiệt độ tối thích 300C)
Lactobacillus sakei subsp. Sakei JCM 1157T (nhiệt độ tối thích 300C)
Lactobacillus sakei TISTR 890 (nhiệt độ tối thích 370C)
Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011 Trường Đại Học Cần Thơ
Việc sử dụng bốn loại vi khuẩn này trong thí nghiệm như là chủng chỉ thị là do có nhiều nghiên cứu cho thấy chúng dễ thể hiện tính đối kháng với những chủng vi khuẩn lactic nào có khả năng tạo ra chất kháng khuẩn.
- Tăng sinh vi khuẩn chuẩn :
Các giống vi khuẩn chuẩn được bảo quản lạnh đông trong môi trường thạch, vì vậy chúng phải được tăng sinh để phục hồi trạng thái hoạt động.
Việc tăng sinh vi khẩn chuẩn hoàn toàn giống như tăng sinh các chủng LAB, cũng với môi trường là MRS. Các ống tăng sinh phải được ủ ở từng nhiệt độ tối thích của từng chủng. Do chủng được bảo quản lạnh đông nên việc tăng sinh lần đầu chưa đủ khả năng phục hồi tốt nhất nên sau khi ủ qua đêm chúng tôi tiến hành tăng sinh lần hai. Dùng pipet hút 5 ml dung dịch MRS cho vào từng ống nghiệm. Dùng micropipet hút 200 µl dịch tăng sinh lần một từ các ống nghiệm cho vào các ống chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn. Mỗi ống dùng các đầu hút khác nhau để tránh hiện tượng nhiễm chéo làm sai lệch kết quả thí nghiệm. Các ống tăng sinh lần hai cũng được ủ qua đêm ở các nhiệt độ tối thích của từng chủng.
- Đỗ đĩa petri lần 1:
Việc đỗ lớp mơi trường này có ý nghĩa tạo một lớp đệm thích hợp, đồng thời cung cấp chất dinh dưỡng cho sự hoạt động của các vi khuẩn chuẩn.
Thành phần của môi trường 1: - MRS 27,5 g - Agar (1,5%) 7,5 g - Nước cất 500 ml
Hoà tan, gia nhiệt và tiệt trùng ở 1210C, 15 phút.
Đỗ 15 ml môi trường 1 vào mỗi đĩa petri, để nguội khoảng 30 phút.
- Đổ đĩa petri lần 2:
Thành phần môi trường 2: - MRS 27,5 g - Agar (1%) 5 g - Nước cất 500 ml
Hồ tan mơi trường, gia nhiệt rồi tiệt trùng ở 1210C , 15 phút
Dùng micropipet lấy 30 µl dịch tăng sinh lần 2 của ống chứa Lactobacillus plantarum ATCC 14917T sau khi đã lắc đều rồi cho vào ống nghiệm. Dùng pipet hút 5 ml môi trường 2 cho vào ống nghiệm này, lắc đều bằng vortex rồi đỗ đĩa ngay. Môi trường 2 phải đảm bảo nhiệt độ không quá 370C để tránh làm ảnh hưởng đến vi khuẩn chuẩn. Các vi khuẩn còn lại thực hiện tương tự.
Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011 Trường Đại Học Cần Thơ
- Cấy mẫu:
Mỗi đĩa petri được kẻ thành 8 phần để tiết kiệm được mơi trường đồng thời có thể thử nghiệm được một lúc nhiều chủng LAB thu được trên cùng một đĩa. Mỗi phần được
đánh số tương ứng với số của các chủng LAB trên các Eppendorf.
Dùng micropipet hút 10µl dung dịch chủng LAB thứ nhất nhỏ theo hướng vng góc với mặt đĩa vào góc phần tám thư nhất đĩa chứa Lactobacillus plantarum ATCC 14917T có số đánh tương ứng với chủng. Từ chủng này, thực hiện tương tự trên ba đĩa chứa Lactobacillus sakei subsp. Sakei JCM 1157T , Lactobacillus sakei TISTR 890 và
Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011 Trường Đại Học Cần Thơ
Trên mỗi chủng LAB thu được chúng tơi bố trí cấy mẫu theo 2 thử nghiệm như sau:
- Ủ mẫu:
Những chủng thử nghiệm trên Lactobacillus plantarum ATCC 14917T và
Lactobacillus sakei subsp. Sakei JCM 1157T được ủ ở 300C. Các chủng thử nghiệm
trên Lactobacillus sakei TISTR 890 và Bacillus Coagulans JCM 2257T được ủ ở 370C. Các tủ ủ được đảm bảo vơ trùng.
• Với mỗi chủng LAB thu được, lập lại hai lần thử nghiệm theo tồn bộ quy trình của thí nghiệm để tìm chủng có tính kháng khuẩn. Khi lặp lại thí nghiệm, chủng LAB trữ
đơng phải được tăng sinh hai lần theo cách thức tương tự như tăng sinh vi khuẩn
chuẩn để phục hồi trạng thái hoạt động.