Nguyên tắc: dùng năng lượng vi sóng đốt nóng tác nhân vô cơ hóa và mẫu trong bình kín. Ở điều kiện này, phản ứng xảy ra dưới áp suất và nhiệt độ cao làm tăng tốc độ vô cơ hóa.
Đây là phương pháp xử lý mẫu hiện đại nhất hiện nay, làm giảm đáng kể thời gian xử lý mẫu, không mất mẫu và vô cơ hóa triệt để, có thể vô cơ hóa nhiều mẫu cùng một đối tượng. Có thể điều khiển quá tình vô cơ hóa từ xa bằng một máy vi tính. Do đó, làm tăng độ an toàn cho người sử dụng và độ tin cậy của hệ thống. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ vô cơ hóa được một lượng mẫu nhỏ, tác nhân vô cơ hóa có độ tinh khiết cao và đòi hỏi thiết bị đắt tiền.
Chương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu
Tìm hiểu nguyên tắc hoạt động, cấu tạo máy, cách vận hành các bộ phận, quy trình phân tích máy AAS, áp dụng phân tích hàm lượng Cu, Zn, Se và Mn (Me) trong cây Xích đồng nam ở Thừa Thiên Huế bằng phương pháp F- AAS với kỹ thuật hóa hơi trực tiếp. Các nội dung nghiên cứu đặt ra trong đề tài gồm:
1) Khảo sát, nghiên cứu điều kiện vô cơ hóa mẫu. 2) Đánh giá độ tin cậy của phương pháp
- Khoảng tuyến tính.
- Xác định giới hạn phát hiện và độ nhạy. - Độ lặp lại.
- Độ đúng.
- So sánh phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm đường chuẩn. 3) Áp dụng thực tế, xác định hàm lượng Me trong cây Xích đồng nam ở Thừa Thiên Huế.
- Xác định Me trong các bộ phận của cây Xích đồng nam - So sánh hàm lượng Me giữa các bộ phận của cây
- So sánh hàm lượng Me trong các bộ phận của cây theo vùng đất trồng. - So sánh hàm lượng Me trong các bộ phận của cây theo đợt lấy mẫu.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.Phạm vi nghiên cứu và chuẩn bị mẫu cho phân tích
2.2.1.1. Phạm vi nghiên cứu và vị trí lấy mẫu:
- Lấy mẫu 2 đợt vào tháng 4 và tháng 6 năm 2011.
- 30 mẫu dược liệu được lấy từ các bộ phận của cây Xích đồng nam ở 3 huyện thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế: huyện Phú Bài (Thôn 1B, xã Thủy Phù); huyện Hương Thủy (Núi Châu Ê, xã Thủy Bằng) và huyện Phú Vang (Thôn Nam Thượng, xã Phú Thượng), tổng cộng 15 mẫu/đợt.
Bảng 2.1: Lý lịch mẫu.
STT
Các bộ phận của
cây Nơi lấy mẫu
Ngày lấy mẫu, kí hiệu mẫu.
Đợt 1 Mẫu Đợt 2 Mẫu 1 Hoa Thôn 1B, Thủy Phù, Phú Bài. 14/04/2011 HB1 06/06/2011 HB2 2 Lá non 14/04/2011 NB1 06/06/2011 NB2 3 Lá già 14/04/2011 GB1 06/06/2011 GB2 4 Thân 14/04/2011 TB1 06/06/2011 TB2 5 Rễ 14/04/2011 RB1 06/06/2011 RB2 6 Hoa
Núi Châu Ê, Thủy Bằng, Hương Thủy. 14/04/2011 HT1 06/06/2011 HT2 7 Lá non 14/04/2011 NT1 06/06/2011 NT2 8 Lá già 14/04/2011 GT1 06/06/2011 GT2 9 Thân 14/04/2011 TT1 06/06/2011 TT2 10 Rễ 14/04/2011 RT1 06/06/2011 RT2 11 Hoa Nam Thượng, Phú Thượng, Phú Vang. 15/04/2011 HV1 06/06/2011 HV2 12 Lá non 15/04/2011 NV1 06/06/2011 NV2 13 Lá già 15/04/2011 GV1 06/06/2011 GV2 14 Thân 15/04/2011 TV1 06/06/2011 TV2 15 Rễ 15/04/2011 RV1 06/06/2011 RV2
2.2.1.2. Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu phân tích là tất cả các bộ phận của cây Xích đồng nam: hoa (hái nguyên cụm), lá, thân và rễ (dùng dao không gỉ, bóc lấy lớp vỏ bên ngoài). Mẫu được rửa sạch bằng nước cất và xác định độ ẩm: Cân mẫu ban đầu được a(g), đem sấy ở nhiệt độ 900C (trong 2h đối với lá, 4h đối với hoa, rễ và thân) sau đó, cân lại được a1(g).
Độ ẩm (%) = a a− 1.100%
a .
Mẫu dược liệu khô được bảo quản trong túi nilon sạch, kín ở nơi khô thoáng. Trước khi phân tích, mẫu dược liệu khô được nghiền thành bột mịn [13].
Bảng 2.2: Kết quả xác định độ ẩm của các mẫu phân tích trong 2 đợt lấy mẫu
STT Ký
hiệu
Khối lượng mẫu trước khi sấy (g)
Khối lượng mẫu
sau khi sấy (g) Độ ẩm (%)
1 HB1 50,32 9,00 82,12 2 NB1 52,46 11,16 78,72 3 GB1 48,12 10,58 78,02 4 TB1 50,48 16,15 68,01 5 RB1 49,95 12,83 74,32 6 HT1 50,07 10,72 78,59 7 NT1 51,23 11,26 78,02 8 GT1 51,93 11,88 77,13 9 TT1 49,06 15,93 67,52 10 RT1 51,73 14,54 71,89 11 HV1 52,10 10,73 79,40 12 NV1 51,08 10,97 78,52 13 GV1 50,95 11,54 77,35 14 TV1 52,55 17,17 67,32 15 RV1 48,23 14,37 70,21 16 HB2 20,50 4,17 79,67 17 NB2 20,76 4,23 77,72 18 GB2 19,50 4,49 76,98 19 TB2 19,76 6,70 65,94 20 RB2 20,06 6,03 69,96 21 HT2 20,50 4,72 76,98 22 NT2 20,68 4,70 77,32 23 GT2 21,08 5,55 73,69 24 TT2 20,15 6,30 68,72 25 RT2 19,76 5,85 70,40 26 HV2 20,36 4,44 78,20 27 NV2 21,78 4,78 78,05 28 GV2 22,31 5,35 76,02 29 TV2 20,50 6,87 66,50 30 RV2 21,50 6,50 69,78
2.2.1.3. Quy trình xử lý mẫu: Phương pháp vô cơ hóa ướt trong lò vi sóng.
Để xác định Cu, Zn, Se và Mn chúng tôi tiến hành như sau: cân khoảng 1,0000g mẫu cho vào bình teflon, thêm 10,00 mL HNO3 65% + 2,00 mL H2O2 30% đặt vào lò vi sóng ở 2000C trong 1h (15 phút đầu đưa nhiệt độ từ 00 – 1000C; và sau đó nâng nhiệt độ lên 2000C, giữ trong 30 phút; 15 phút còn lại đưa nhiệt độ về 1000C), áp suất 5 bar, công suất 500W. Để nguội, lọc bỏ bã, cho dịch lọc vào bình định mức dung tích 50 mL (tráng rửa cốc, giấy lọc), lắc đều, thêm nước cất vừa đủ đến vạch, lắc kỹ. Dung dịch thu được dùng để xác định Cu, Zn, Se và Mn bằng phương pháp AAS với các thông số tích hợp nhất đã được khảo sát [13].
2.2.1.4. Thí nghiệm trắng:
Trong phân tích vết, do sự nhiễm bẩn thường xảy ra, nên để kiểm tra mức nhiễm bẩn của toàn bộ hệ thống phân tích (các hóa chất, dụng cụ, máy móc được sử dụng, kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích, phương pháp phân tích,...), bắt buộc phải tiến hành song song thí nghiệm trắng.
Thí nghiệm trắng được tiến hành hoàn toàn tương tự như khi phân tích mẫu thật, nhưng ở đây là thực hiện trên mẫu trắng - là mẫu được chuẩn bị có thành phần giống với mẫu thật, nhưng không chứa chất phân tích. Từ đó, tiến hành hiệu chỉnh kết quả phân tích bằng cách trừ đi kết quả thu được từ thí nghiệm trắng.
2.2.1.5. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Từ dung dịch chuẩn gốc đồng, kẽm và mangan (nồng độ 1000 mg/L) pha dãy các dung dịch có nồng độ 0,2; 0,4; 0,8; 1,0 và 2,0 mg/L:
Tiến hành:
(1) Cho vào bình định mức dung tích 100mL: 1mL dung dịch chuẩn gốc đồng 1000 mg/L + 1mL dung dịch chuẩn gốc kẽm 1000 mg/L + 1mL dung dịch chuẩn gốc mangan 1000 mg/L, định mức đến vạch bằng nước cất, lắc đều. Dung dịch thu được chứa đồng, kẽm và mangan có nồng độ 10 mg/L.
(2) Đánh dấu 5 bình định mức dung tích 25mL lần lượt từ 1 đến 5. Cho dung dịch chuẩn 10mg/L đã chuẩn bị ở (1) vào 5 bình định mức trên theo thứ tự với thể tích tương ứng là 0,5mL; 1,0mL; 2,0mL; 2,5mL và 5,0mL rồi định mức đến vạch bằng nước cất.
2.2.2. Các điều kiện đo
Các thông số trên máy rất quan trọng, nó quyết định đến độ nhạy của máy. Để xác định hàm lượng Cu, Zn, Se và Mn bằng phương pháp F – AAS trong các bộ phận của cây Xích đồng nam ở Thừa Thiên Huế, chúng tôi sử dụng những điều kiện đo như sau:
Bảng 2.3: Các giá trị thích hợp hợp cho phương pháp đo
Nguyên tố Các thông số Mn Cu Zn Nguồn Đèn catot rỗng Mangan Đèn catot rỗng đồng Đèn catot rỗng kẽm
Loại đèn Cao Cao Cao
Cường độ đèn (mA) 10 6 8
Bước sóng (nm) 279,5 324,8 213,9
Độ rộng khe (nm) 0,2 0,7 0,7
Chiều cao buner(mm) 5 5 5
Khí ngọn lửa C2H2 - không khínén C2H2 - không khínén C2H2 - không khínén
Áp lực nén khí (kPa) 160 160 160
Kiểu đo AA AA AA
Thời gian chờ (giây) 5 5 5
Thời gian đo (giây) 2 2 3
2.2.3. Tiến hành
Đặt các thông số như ở mục 2.2.2, bật đèn, để ổn định đèn 20 – 30 phút. Mồi ngọn lửa, để ổn định ngọn lửa 5 – 10 phút. Tiến hành đo độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn, lập đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ dãy chuẩn. Đo độ hấp thụ của các dung dịch mẫu phân tích, tính toán nồng độ Mn, Cu và Zn trong dung dịch dựa vào đường chuẩn. Từ đó, kết hợp với kết quả đo được của mẫu trắng để suy ra khối lượng (mg/kg chất khô) của Me trong các bộ phận của cây Xích đồng nam theo công thức (2.1) ở mục 2.2.5.
2.2.4. Phương pháp định lượng
Định lượng Cu, Zn, Se và Mn trong mẫu bằng phương pháp F – AAS với kỹ thuật hóa hơi trực tiếp: dùng năng lượng nhiệt của ngọn lửa đèn khí khi đốt cháy một hỗn hợp khí để hóa hơi mẫu phân tích (mục 1.4.5.3). Đối với kỹ thuật này chỉ
cần đưa selen về dạng vô cơ hòa tan trong dung dịch mà không cần quan tâm selen ở mức oxi hóa nào.
Để xác định Cu, Zn, Se và Mn chúng tôi chuẩn bị dung dịch phân tích theo mục 2.2.1.3, tiến hành định lượng như ở mục 2.2.3. Mỗi mẫu được thực hiện 3 lần đo để lấy giá trị trung bình.
Sau khi tiến hành chạy mẫu trên máy AAS, kết quả nhận được là độ hấp thụ của chất cần phân tích, độ hấp thụ này phản ánh nồng độ của chúng có trong mẫu. Chúng tôi sử dụng phương pháp đường chuẩn để tính toán nồng độ của chúng dựa theo phương trình đường chuẩn sau:
y = a + bx
Trong đó, x: nồng độ; y: độ hấp thụ
a, b: các hệ số tỉ lượng của phương trình bậc nhất.
Từ độ hấp thụ của các dung dịch phân tích, tính toán nồng độ Me trong mẫu phân tích dựa vào đường chuẩn.
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm
Sử dụng Microsoft Excel 2003 và Origin 6.0 để xử lý số liệu thực nghiệm, thiết lập phương trình đường chuẩn theo phương pháp bình phương tối thiểu và tính hệ số tương quan R, giới hạn phát hiện, độ nhạy…
- Công thức tính khối lượng Me từ nồng độ:
C.V X =
m (2.1)
Trong đó,
X là khối lượng kim loại trong mẫu (mg/kg chất khô) C là nồng độ kim loại trong mẫu (mg/L)
V là thể tích đã được định mức trong xử lý mẫu (mL) m: Khối lượng mẫu phân tích.
- Giá trị trung bình: ∑n i i=1 1 x = x n (2.2) - Độ lệch chuẩn: ∑n ( )2 i i=1 x - x S = n -1 (2.3)
- Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) = .100S
x (2.4)
- Khoảng tin cậy: e = t.S
±
n (2.5)
- So sánh độ chính xác của hai phương pháp:
2 A TN 2 B S F = S (SA>SB) (2.6)
FLT tra bảng với bậc tự do kA = nA -1 và kB = nB -1 ở mức tin cậy 95%. FTN < FLT : Hai phương pháp có độ chính xác giống nhau với p > 0,05. FTN < FLT : Hai phương pháp có độ chính xác khác nhau với p < 0,05. - So sánh hai giá trị trung bình:
( ) 2 ( ) 2 A A B B c A B n -1 S + n -1 S S = n + n - 2 (2.7) A B a,k c A B x - x t = 1 1 S . + n n (k = n + n - 2A B ) (2.8)
Nếu t(α;κ)< t(0,05;κ) thì hai giá trị trung bình giống nhau ở mức ý nghĩa p > 0,05. Để kết luận chắc chắn hơn có thể so sánh t(α;κ) với t(0,1;κ) (Nếu t(α;κ) < t(0,1;κ) thì hai giá trị trung bình giống nhau ở mức ý nghĩa p > 0,1)
Nếu t(α;κ) > t(0,05;κ) thì hai giá trị trung bình khác nhau ở mức ý nghĩa p < 0,05. Để kết luận chắc chắn hơn có thể so sánh t(α;κ) với t(0,01;κ) (Nếu t(α;κ) > t(0,01;κ) thì hai giá trị trung bình khác nhau ở mức ý nghĩa p < 0,01.
2.2.6. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp AAS
2.2.6.1. Khoảng tuyến tính
Để khảo sát khoảng tuyến tính đối với mỗi ion kim loại, chúng tôi tiến hành xác định độ hấp thụ của dung dịch chuẩn chứa đồng thời 3 kim loại Mn, Cu, Zn đã pha ở mục 2.2.1.5 và lập đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ và nồng độ dãy chuẩn. Mỗi nồng độ được thực hiện 3 lần đo để lấy giá trị trung bình.
2.2.6.2. Xác định giới hạn phát hiện và độ nhạy
Giới hạn phát hiện (GHPH) của phương pháp đối với mỗi kim loại được tính theo “quy tắc 3σ ” và dựa vào hồi quy tuyến tính:
yLOD = yB + 3σB hay yLOD = yB + 3SB (2.9) Trong đó, y: độ hấp thụ ứng với GHPH
yB: tín hiệu mẫu trắng
σB (hay SB): độ lệch chuẩn của tín hiệu mẫu trắng.
Để tính yB và SB, thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính dạng y = a + bC, Từ đó chấp nhận tín hiệu mẫu trắng (yB) là tín hiệu khi C = 0, suy ra yB = a. Độ lệch chuẩn của tín hiệu mãu trắng (SB) được chấp nhận bằng độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường hồi quy tuyến tính, tức là:
( )2 1 / 2 = − = = − ∑n i i i B y x y Y S S n (2.10)
Ở đây: yi là giá trị thực nghiệm của y
Yi là các giá trị tính từ phương trình hồi qui tuyến tính của y Từ (2.9) và (2.10), ta có:
y = yB + 3SB = a + 3Sy/x (2.11) GHPH được tính từ phương trình hồi quy tuyến tính y = a + bx và từ (2.11):
x ứng với GHPH hay 3Sy/x GHPH =
b
Trong đó, b là độ dốc của đường hồi quy tuyến tính và cũng là độ nhạy của phương pháp.
Để xác định GHPH, người ta xây dựng đường hồi quy tuyến tính ở gần gốc tọa độ (trong khoảng hẹp của nồng độ các kim loại cần xác định ở gần gốc tọa độ).
Giới hạn định lượng (GHĐL) là tín hiệu thấp nhất trên một đường chuẩn tin cậy. Người ta thường chấp nhận GHĐL = 10yB + 10 SB, hay một cách gần đúng:
GHĐL = 3 ÷ 4 GHPH
2.2.6.3. Độ lặp lại
Chuẩn bị 7 mẫu dung dịch phân tích GB theo mục 2.2.1.3, tiến hành định lượng như ở mục 2.2.3, mỗi mẫu được thực hiện 3 lần đo để lấy giá trị trung bình.
2.2.6.4. Độ đúng
Để đánh giá độ đúng của phương pháp, chúng tôi thêm một lượng Cu, Zn và Mn chuẩn nhất định vào dung dịch phân tích GB đã xác định hàm lượng Cu, Zn và Mn ở mục 2.2.6.3 sao cho nồng độ của dung dịch đem đo nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Xác định nồng độ Cu, Zn và Mn tổng theo mục 2.2.3. Lấy nồng độ Cu, Zn và Mn tổng trừ đi nồng độ của Cu, Zn và Mn có trong mẫu phân tích sẽ xác định được lượng Cu, Zn và Mn chuẩn cho vào.
2.2.6.5. Phương pháp thêm đường chuẩn
Để biết nền của mẫu phân tích có ảnh hưởng tới kết quả đo hay không, chúng tôi tiến hành đo trên mẫu GB cả hai phương pháp: đường chuẩn, thêm đường chuẩn. Tiến hành: chuẩn bị 4 bình định mức 10mL, hút vào mỗi bình 5,0 mL dung dịch phân tích đã chuẩn bị ở mục 2.2.6.3, thêm lần lượt 0,0; 0,5; 1,0; 1,5 mL dung dịch chuẩn chứa Cu, Zn và Mn 10 ppm đã chuẩn bị ở mục 2.2.1.5 vào 4 bình định mức, thêm nước cất vừa đủ đến vạch, lắc đều. Tiến hành xác định nồng độ Cu, Zn và Mn trong dung dịch như ở mục 2.2.3, sử dụng phương pháp thêm đường chuẩn.
2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất2.3.1. Thiết bị và dụng cụ 2.3.1. Thiết bị và dụng cụ
Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS-3300 của hãng Perkin Elmer (Mỹ), cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sỹ) có độ chính xác 0,1mg; lò vi sóng Speed Wase, Model: MWS-3 – BERGHOF (Đức), tủ sấy ULM – 500 (memmert).
Bình định mức 100mL, 50mL, 25mL; pipet 1mL, 5mL, 10mL; phểu lọc, cốc thủy tinh, giấy lọc, lọ nhựa PE sạch 50mL.
2.3.2. Hóa chất
Do yêu cầu nghiêm ngặt của phép đo AAS nên nước cất và hóa chất sử dụng phải có độ tinh khiết cao. Đã được kiểm tra nồng độ nguyên tố bằng phương pháp AAS trước khi dùng.
Các hóa chất và dung môi sử dụng để nghiên cứu đều của hãng Merck, gồm: