6. Bố cục của khóa luận
2.5.Định tính alkaloid trong dịch chiết
Alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi chung là thuốc thử alkaloid và chia làm 2 loại: phản ứng gây tủa và phản ứng màu đặc hiệu. Do điều kiện thí nghiệm nên đề tài này chỉ sử dụng 2 thuốc thử tạo tủa là Mayer và Bouchardat.
Chuẩn bị 3 ống nghiệm đựng dịch chiết hạt tiêu đen. Một ống làm ống chuẩn, 2 ống còn lại lần lượt cho thuốc thử Mayer và Bouchardat vào mỗi ống. Để yên, quan sát hiện tượng và nhận xét.
2.6. Xác định thành phần hóa học của hạt tiêu đen bằng ph ng pháp GC-MS [6], [8], [9]
Cân 20g bột tiêu đen cho vào bộ chiết soxhlet, chiết với 200ml etanol 960 ở nhiệt độ 800C trong thời gian 8 giờ. Dịch chiết thu được đem cô đuổi dung môi thu được cắn. Cắn được phân tích trên máy sắc kí ghép khối phổ để định danh một số thành phần hóa học có trong hạt tiêu đen.
Sắc ký khí ghép khối phổ là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hệ thống được ghép nối giữa một thiết bị sắc ký và một thiết bị phổ khối lượng, điều khiển tự động bằng máy tính.
Sắc ký khí được dùng để chia tách hỗn hợp các chất ra các phần riêng lẻ. Pha động là một khí trơ (giống như helium) sẽ mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh. Mỗi chất trong hỗn hợp pha động tương tác khác nhau với pha tĩnh, hợp chất tương tác nhanh ra khỏi cột trước, hợp chất tương tác chậm ra khỏi cột sau. Mỗi chất chia tách, rửa giải đi ra khỏi cột và đi vào đầu dò sẽ tạo thành một peak trong sắc đồ với thời gian lưu đặc trưng cho từng chất trong cùng điều kiện sắc kí.
Khối phổ được dùng để xác định các chất hóa học dựa trên cấu trúc của nó. Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có dòng điện ion hóa và bị bắn phá thành các mảnh ion có khối lượng và điện tích. Các mảnh ion này sẽ được tách biệt khỏi nhau trong một từ trường theo tương quan giữa m và e. Phổ khối đồ thu được với trục hoành là giá trị m/e (số khối z) và trục tung là cường độ tín hiệu tương đối. Cấu trúc này được so sánh với một thư viện cấu trúc các chất đã biết trong thư viện phổ để định danh các hợp chất trong mẫu.
Sắc ký khí ghép khối phổ dùng để phân tích các hỗn hợp hóa chất phức tạp như xác định thành phần các chất hóa học, độc chất, kháng sinh, đánh giá độ tồn lưu của hóa chất diệt côn trùng khác nhau trong các vật liệu hoặc hợp chất khác nhau.
2.7. Thử hoạt tính sinh học [3], [16], [18]
2.7.1. Hoạt tính kháng sinh
Thử hoạt tính vi sinh vật được kiểm định theo phương pháp khuyếch tán trên thạch, hoặc phương pháp đo độ đục trong môi trường lỏng tại phòng Thử hoạt tính sinh học – Viện Hóa học.
Các chủng vi sinh vật thử gồm:
- Vi khuẩn Gram (+): Staphylococccus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus
fermentum.
- Vi khuẩn Gram (-): Salmonella enterica, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa.
- Nấm: Candida albican.
2.7.2. Hoạt tính độc tế bào
Phương pháp thử độ độc tế bào là một phép thử nhằm phát hiện các chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ở điều kiện invitro. Trong phạm vi khóa luận này, cặn chiết hạt tiêu đen được thử khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô KB theo phương pháp Scudiero và cộng sự tại phòng Thử hoạt tính sinh học – Viện Hóa học. Phương pháp thử: tế bào ung thư được duy trì liên tục ở các điều kiện chuẩn và tiến hành thử nghiệm với cặn chiết hạt tiêu đen được pha ở 5 thang nồng độ khác nhau (128, 32, 8, 2 và 0.5 μg/ml) trên 96 đĩa giếng. Các đĩa thử nghiệm này được ủ trong tủ ấm CO2 ở 370C để tế bào tiếp tục phát triển. Sau 3 – 5 ngày, các tế bào này được xử lý và xác định giá trị ức chế sinh trưởng từ đó tính được giá trị IC50.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả xác định một s chỉ tiêu hóa lý của hạt tiêu đen
3.1.1. Độ ẩm
Tiến hành xác định độ ẩm với số lượng mẫu được lấy là 5 mẫu. Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ẩm trong hạt tiêu đen
STT m1 (g) m2 (g) m3 (g) W (%) WTB (%) 1 81.109 5.004 85.383 14.588 14.702 2 83.012 5.006 87.269 14.962 3 86.384 5.003 90.656 14.611 4 98.294 5.006 102.559 14.802 5 101.010 5.005 105.287 14.545
Từ bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình trong hạt tiêu đen tương đối cao: 14.702%. Với độ ẩm này cần phải cẩn trọng trong việc bảo quản nguyên liệu trong suốt quá trình nghiên cứu, tránh bị nấm mốc.
3.1.2. Hàm lượng tro
Lấy 5 mẫu hạt tiêu đen đã xác định độ ẩm ở trên, nung trong lò nung ở nhiệt độ 6000C. Hàm lượng tro được lấy trung bình từ 5 mẫu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng tro trong hạt tiêu đen
STT m4 (g) m2 (g) m5 (g) X (%) XTB (%) 1 32.282 5.004 32.490 4.157 4.184 2 32.098 5.006 32.316 4.355 3 30.252 5.003 30.449 3.938 4 31.567 5.006 31.788 4.415 5 28.294 5.005 28.497 4.056
Vậy hàm lượng tro trung bình trong hạt tiêu đen là: 4.184%. Tro này có thể là một số muối kim loại và các chất vô cơ.
3.1.3. Hàm lượng kim loại nặng
Mẫu hạt tiêu đen sau khi tro hoá hoàn toàn (như mục 2.3.2.), được hoà tan trong dung dịch axit HNO3 loãng và định mức bằng nước cất trong bình định mức 50ml. Sau đó xác định hàm lượng các kim loại nặng bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS tại Đài Khí tượng Thủy văn khu vực Trung Trung Bộ, 660 - Trưng Nữ Vương - Đà Nẵng. Kết quả phân tích được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát hàm lượng kim loại nặng trong hạt tiêu đen
Kim loại Hàm l ng (mg/l) QCVN (mg/l)
Cu 0,8472 20,0
Pb 0,3942 2,0
Kết quả khảo sát trên cho thấy hàm lượng một số các kim loại nặng (Cu, Pb) trong hạt tiêu đen nằm dưới mức giới hạn tối đa cho phép của QCVN 8- 2:2011/BYT về giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong gia vị. Vì thế, việc sử dụng hạt tiêu đen trong các lĩnh vực liên quan như dược phẩm, thực phẩm, … sẽ không gây hại cho sức khỏe con người.
3.2. Kết quả khảo sát các điều kiện chiết
3.2.1. Thời gian chiết
Cân 20g bột hạt tiêu đen cho vào bộ soxhlet, chiết với 250 ml etanol 960. Tiến hành chiết soxhlet ở nhiệt độ 800
C trong các khoảng thời gian khác nhau: 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ. Dịch chiết thu được đem đo UV- VIS tại bước sóng 417nm (hình 3.1). Giá trị mật độ quang của các mẫu được thể hiện ở bảng 3.4.
Kết quả khảo sát thời gian chiết được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả mật độ quang của các dịch chiết theo thời gian
Và được biểu diễn qua đồ thị như trong hình 3.2.
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian
Qua kết quả thu được ở bảng 3.4 và hình 3.2 ta thấy thời gian chiết tăng, làm tăng số lần chiết, tăng diện tích tiếp xúc và độ khuếch tán của dung môi vào nguyên liệu, nên có thể chiết được nhiều hoạt chất dẫn đến mật độ quang tăng. Giá trị mật độ quang lớn nhất tại thời gian 8 giờ. Nếu tiếp tục tăng thời gian chiết, giá trị D giảm, do chiết nóng trong thời gian dài sẽ làm caryophyllene (một thành phần của tinh dầu) bay hơi. Hơn nữa nguyên liệu ngâm trong dung môi thời gian dài sẽ trương nở làm bít lổ thông của màng tế bào, cản trở khả năng thấm của dung môi, giảm hiệu suất chiết.
Mẫu Thời gian (h) Mật độ quang (D)
1 4 1.8810 2 6 2.2627 3 8 2.3864 4 10 2.1279 5 12 2.1293 Thời gian (h) D 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4 6 8 10 12
Như vậy thời gian chiết tối ưu là 8 giờ.
3.2.2. Tỷ lệ rắn lỏng
Cân 20g bột hạt tiêu đen cho vào giấy lọc, gói lại thật kỹ, cuộn lại bằng chỉ, rồi cho vào bộ chiết soxhlet. Tiến hành chiết ở nhiệt độ 800C trong thời gian 8 giờ với thể tích dung môi etanol 960
lần lượt là: 160ml, 180ml, 200ml, 220ml, 240ml. Dịch chiết thu được có màu vàng lục, đem đo UV- VIS tại bước sóng 417nm (hình 3.3). Giá trị mật độ quang của các mẫu được thể hiện ở bảng 3.5.
Hình 3.3. Dịch chiết với các tỉ lệ R/L khác nhau
Kết quả khỏa sát tỷ lệ rắn lỏng được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả mật độ quang của các dịch chiết theo tỉ lệ rắn-lỏng
Mẫu Tỉ lệ R/L Mật độ quang (D) 1 1/8 2.0654 2 1/9 2.2561 3 1/10 2.4012 4 1/11 2.3852 5 1/12 2.3859
Và được biểu diễn qua đồ thị như trong hình 3.4
Hình 3.4. Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào tỉ lệ R/L
Qua kết quả và đồ thị ở bảng 3.5 và hình 3.4 ta nhận thấy cùng khối lượng nguyên liệu nhưng khi tăng thể tích dung môi thì giá trị mật độ quang ngày càng tăng. Nguyên nhân là do khi thể tích nhỏ, dung môi nhanh bão hòa; còn khi thể tích lớn sẽ làm tăng độ thẩm thấu, độ hòa tan của dung môi, tăng khả năng tiếp xúc với nguyên liệu dẫn đến tăng hiệu suất chiết. Đến một thể tích nhất định, lượng hoạt chất được tách ra gần như hoàn toàn và không thể chiết thêm được nữa khi tăng thể tích dung môi. Giá trị mật độ quang cực đại đạt được ở mẫu 3. Sau điểm cực đại, mật độ quang giảm không đáng kể và ổn định. Chứng tỏ tại điều kiện này, dịch chiết của hạt tiêu đen chứa lượng chất chiết là lớn nhất.
Như vậy tỷ lệ R/L tối ưu là 1/10.
3.3. Kết quả định tính alkaloid trong dịch chiết hạt têu đen
Dịch chiết hạt tiêu đen với etanol 960
đem thử định tính alkaloid với các thuốc thử Mayer và Bouchardat, ta có kết quả thử định tính alkaloid như sau:
* Thuốc thử Mayer:
Ống 1: Ống chuẩn chứa dịch chiết.
Ống 2: Ống thử chứa dịch chiết rồi nhỏ từ từ thuốc thử Mayer vào, nhận thấy kết tủa màu vàng trắng, không tan trong dung dịch axit H2SO4 loãng. (Hình 3.5)
Vdm (ml) D 1.8 1.9 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 160 180 200 220 240
* Thuốc thử Bouchardat:
Ống 3: Ống chuẩn chứa dịch chiết.
Ống 4: Ống thử chứa dịch chiết rồi nhỏ từ từ thuốc thử Bouchardat vào, nhận thấy có kết tủa màu nâu đậm. (Hình 3.6)
=> Kết luận: Dịch chiết hạt tiêu đen có chứa alkaloid.
3.4. Kết quả xác định thành phần hóa học của dịch chiết hạt tiêu đen bằng ph ng pháp GC-MS ph ng pháp GC-MS
Cân 20g bột hạt tiêu đen cho vào giấy lọc, gói lại thật kỹ, cuộn lại bằng chỉ, rồi cho vào bộ chiết soxhlet. Tiến hành chiết ở nhiệt độ 800C trong thời gian 8 giờ với 200 ml dung môi etanol 960. Dịch chiết thu được có màu vàng lục. Cô đuổi dung môi bằng máy cô quay chân không thu được cắn. Gửi cắn đi phân tích trên máy sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS) tại Trung tâm Kỹ Thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 2, số 2 Ngô Quyền –Sơn Trà –Đà Nẵng.
Kết quả định danh các cấu tử trong cắn hạt tiêu đen bằng GC-MS được thể hiện ở sắc kí đồ hình 3.7 và phổ khối hình 3.8, 3.9:
Hình 3.5. Dịch chiết với thuốc thử Mayer
Hình 3.6. Dịch chiết với thuốc thử Bouchardat
Hình 3.8. Phổ khối của piperine.
Hình 3.9. Phổ khối của Caryophyllene
Từ sắc kí đồ - khối phổ thu được cho thấy thành phần chính của cắn chiết từ hạt tiêu đen là những hợp chất alkaloid và secquiterpen, đây là những hợp chất gây nên vị cay cho hạt tiêu đen và có hoạt tính sinh học. Qua phân tích phổ GC-MS và đối chiếu dữ liệu trong thư viện phổ chuẩn, bước đầu thống kê được một số cấu tử với hàm lượng đáng kể, có thời gian lưu và tỉ lệ phần trăm được trình bày trong bảng 3.6:
Bảng 3.6. Thành phần hóa học của cắn chiết hạt tiêu đen
STT TR
Hàm l ng
(%)
Định danh Công thức cấu tạo
1 12,436 13,11 Caryophyllene CH3 CH3 H H C H3 CH2 2 13,736 2,02 Naphthalene, decahydro-4a- methyl-1methylene-7-(1- methylethenyl)-, [ 4aR-(4aα, 7α, 8aβ)] CH2 CH3 CH2 CH3 H 3 30,645 1,97 Chavixin O O N O 4 31,872 2,49 2,3-Dihydro-7- methoxyfuro(2,3-b)quinoline N O O C H3 5 32,368 80,41 Piperine O O N O
Bảng 3.6 cho thấy trong thành phần cắn chiết hạt tiêu đen, cấu tử piperine chiếm tỉ lệ lớn nhất (80,41%). Chất này có tác dụng ức chế tế bào ung thư, kích thích hình thành sắc tố trong da, làm tăng sinh khả dụng của một số chất dinh dưỡng và thuốc. Đồng phân quang học của piperine là chavixin chiếm 1,97%, chất gây nên vị cay hắc của hạt tiêu đen. Bên cạnh đó còn có caryophyllene (13,11%) là hoạt chất chống viêm và một số cấu tử khác có hàm lượng phần trăm thấp.
3.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết hạt tiêu đen
Bột hạt tiêu đen tiến hành chiết soxhlet với dung môi etanol 960
trong thời gian 8 giờ, dịch chiết thu được có màu lục hơi vàng. Cô đuổi dung môi thu được cắn chiết. Gửi mẫu cắn chiết này tới Phòng thử hoạt tính sinh học – Viện Hóa học, 18 - Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội.
3.5.1. Thử hoạt tính kháng sinh
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh
Theo kết quả trên cho thấy dịch chiết hạt tiêu đen không có hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật Gram (-): Salmonella enterica, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và nấm Candida albican. Chỉ có tác dụng lên một chủng
vi sinh vật Gram (+) Bacillus subtilis với giá trị IC50 là 82,53μg/ml. Bacillus subtilis hay còn gọi là trực khuẩn, là tác nhân làm hỏng và gây vị chua nặng ở thức ăn. Điều này lý giải vì sao hạt tiêu thường được dùng như chất bảo quản thịt và các loại thức ăn khỏi bị ôi thiu.
3.5.2. Thử hoạt tính độc tế bào
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào
Dịch chiết được kiểm tra hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thông qua phép thử gây độc tế bào với dòng tế bào ung thư biểu mô KB. Trong khi chất đối chứng ellipticin cho giá trị IC50 là 0,51μg/ml thì dịch chiết hạt tiêu đen theo kết quả trên cho thấy không có khả năng ức chế dòng tế bào này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã thu được các kết quả sau đây:
- Đã xác định được một số chỉ tiêu hóa lý: Độ ẩm: 14.702%; hàm lượng tro: 4.184%; hàm lượng kim loại nặng phù hợp với tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với gia vị.
- Đã khảo sát và tìm được các điều kiện chiết tối ưu: thời gian chiết là 8h, tỷ lệ rắn – lỏng là 1/10.
- Bằng phương pháp GC-MS đã định danh được thành phần hóa học một số hợp chất trong cắn chiết hạt tiêu đen: Piperine (80,41%); Caryophyllene (13,11%); 2,3-Dihydro-7-methoxyfuro(2,3-b)quinoline (2,49%); Naphthalene, decahydro-4a- methyl-1methylene-7-(1-methylethenyl)-, [ 4aR-(4aα, 7α, 8aβ)] (2,02%); Chavixin (1,97%).
- Dịch chiết hạt tiêu đen có hoạt tính kháng chủng vi sinh vật gram (+)
Bacillus subtilis với giá trị IC50 là 82,53μg/ml, không có hoạt tính với các chủng Gram (-) cũng như không có khả năng ức chế với dòng tế bào ung thư biểu mô KB.
II. Kiến nghị
Thông qua kết quả của đề tài, tôi mong muốn đề tài được phát triển rộng hơn về một số vần đề như:
- Tách và phân lập các cấu tử tinh khiết từ dịch chiết hạt tiêu đen. Trên cơ sở