CHƯƠNG 2 CƠ SỞ THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Bố trí thí nghiệm
2.3.3. Các bước thực nghiệm biến tính tinh bột hạt mít
+ Tạo huyền phù tinh bột:
Tinh bột hạt mít được khuấy và duy trì ở nhiệt độ, nồng độ huyền phù, pH thích hợp được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 0.5M.
+ Oxy hóa tinh bột:
- Tác nhân NaClO: Để biến tính tinh bột, cho thêm vào hỗn hợp huyền phù dung
dịch NaClO có nồng độ chlor hoạt động cần khảo sát. Khuấy đều hỗn hợp ở nhiệt độ phù hợp trong khoảng thời gian khảo sát và duy trì pH ổn định cho đến khi đạt được mức độ oxy hóa cần thiết.
- Tác nhân H2O2: Để biến tính tinh bột, cho thêm vào hỗn hợp huyền phù lượng
xúc tác CuSO4 nhất định và thể tích dung dịch H2O2 có nồng độ cần khảo sát. Khuấy đều hỗn hợp ở nhiệt độ phù hợp trong khoảng thời gian khảo sát và duy trì pH ổn định cho đến khi đạt được mức độ oxy hóa cần thiết.
+ Trung hịa:
Kết thúc thời gian oxy hóa, trung hịa hỗn hợp bằng dung dịch HCl 0.5M (với tác nhân NaClO) hoặc dung dịch H2SO4 0.5M (với tác nhân H2O2) đến khi pH = 7.
+ Ly tâm rửa:
Sau khi trung hòa, mẫu đem qua ly tâm (tốc độ 5000 vòng/phút trong 15 phút), thu phần tinh bột lắng cặn thành khối đem hoà tan vào nước và tiếp tục lặp lại quá trình ly tâm thêm 3 lần để rửa sạch tinh bột bằng nước, và rửa lại lần cuối bằng ethanol (1:5).
+ Sấy:
Tinh bột sau khi rửa xong được đem đi sấy khơ ở 50oC trong 16 giờ nhằm mục đích giảm độ ẩm của tinh bột, tiêu diệt vi sinh vật, tăng thời gian bảo quản tinh bột.
2.3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến q trình oxy hóa tinh bột hạt mít
Nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến q trình oxy hóa tinh bột hạt mít bằng hai tác nhân NaClO và H2O2 được thiết lập theo bảng 2.2 và bảng 2.3.
Bảng 2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến q trình oxy hóa bằng tác nhân NaClOYếu tố ảnh Yếu tố ảnh Thông hưởng số TN Nồng độ oxy hóa Nồng độ huyền phù pH Nhiệt độ phản ứng Thời gian phản ứng Nồng độ oxy hóa (%) 1; 2; 3; 4; 5; 6 Giá trị tối ưu Giá trị tối ưu Giá trị tối ưu Giá trị tối ưu Nồng độ huyền phù (%) 40 20; 25;30; 35; 40; 45 Giá trị tối ưu Giá trị tối ưu Giá trị tối ưu pH 9 9 7; 8; 9;10;11 Giá trị tối ưu Giá trị tối ưu Nhiệt độ (oC) 40 40 40 30; 40; 50; 60; 70 Giá trị tối ưu Thời gian (phút) 90 90 90 90 30; 60; 90; 120; 180
Bảng 2.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình oxy hóa bằng tác nhân H2O2
Yếu tố ảnh Thông hưởng số TN Nồng độ oxy hóa Nồng độ huyền phù pH Nhiệt độ phản ứng Thời gian phản ứng Nồng độ oxy hóa (%) 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5; 3 Giá trị tối ưu Giá trị tối ưu Giá trị tối ưu Giá trị tối ưu Nồng độ huyền phù (%) 20 5;10;15;20; 25; 30; 35 Giá trị tối ưu Giá trị tối ưu Giá trị tối ưu pH 8.0 8.0 5; 6; 7; 8; 9; 10 Giá trị tối ưu Giá trị tối ưu Nhiệt độ (oC) 40 40 40 50; 60; 7030; 40; Giá trị tối ưu Thời gian (phút) 90 90 90 90 30; 60; 90; 120; 150; 180
2.3.5. Phương pháp phân tích xác định nồng độ chất oxy hoá2.3.5.1. Xác định nồng độ chlor hoạt động [50] 2.3.5.1. Xác định nồng độ chlor hoạt động [50]
Dựa trên cơ sở của phương pháp chuẩn độ oxy hóa khử cụ thể là phương pháp Iodine và phương pháp chuẩn độ trung hòa.
Cho một mẫu nước Javen một lượng dung dịch KI 10% có dư, thực hiện phản ứng trong mơi trường HCl giải phóng ra một lượng I2 tương đương với lượng Cl2 hoạt động trong mẫu. Phương trình phản ứng như sau:
NaOH + HCl → NaCl +H2O
NaClO + 2KI + 2HCl → NaCl + 2KCl + I2 + H2O
Sau đó chuẩn lượng I2 sinh ra bằng Na2S2O3 (đã chuẩn hóa). Nhận biết điểm tương đương bằng chỉ thị hồ tinh, ở điểm tương đương dung dịch chuyển từ màu xanh đen qua khơng màu.
Phương trình phản ứng như sau:
Na2S2O3 + I2 → 2NaI + Na2S4O6 Nồng độ chlor hoạt động được tính theo cơng thức:
Trong đó:
Cc: Nồng độ dung dịch Na2S2O3 (N)
Vc: Thể tích dụng dịch Na2S2O3 tiêu tốn (ml) V : Thể tích dung dịch nước Javen (ml) d : Khối lượng riêng của nước Javen (g/l).
2.3.5.2. Xác định nồng độ H2O2 [50]
Dựa trên cơ sở của phương pháp chuẩn độ oxy hóa khử cụ thể là phương pháp Iodine.
Cho một mẫu nước H2O2 một lượng dung dịch KI 10% có dư, thực hiện phản ứng trong mơi trường H2SO4 6N giải phóng ra một lượng I2 tương đương với lượng hoạt động trong mẫu. Phương trình phản ứng như sau:
Sau đó chuẩn lượng I2 sinh ra bằng Na2S2O3 (đã chuẩn hóa). Nhận biết điểm tương đương bằng chỉ thị hồ tinh, ở điểm tương đương dung dịch chuyển từ màu xanh đen qua khơng màu.
Phương trình phản ứng như sau:
2Na2S2O3 + I2 → 2NaI + Na2S4O6 Nồng độ H2O2 được tính theo cơng thức:
Trong đó:
Cc: Nồng độ dung dịch Na2S2O3 (N)
Vc : Thể tích dụng dịch Na2S2O3 tiêu tốn (ml) V : Thể tích dung dịch nước H2O2 (ml) d : Khối lượng riêng của nước H2O2 (g/l)
2.3.6. Phương pháp phân tích xác định thành phần chính của tinh bột2.3.6.1. Xác định độ ẩm – TCVN 9934:2013 2.3.6.1. Xác định độ ẩm – TCVN 9934:2013
+ Nguyên tắc:
Để xác định độ ẩm trong tinh bột, ta thường sử dụng phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi. Mẫu được nghiền mịn và sấy khô trong tủ sấy đã đạt được nhiệt độ tiêu chuẩn. Độ ẩm được tính từ lượng mất đi trong quá trình sấy.
+ Quy trình:
Tiến hành cân chính xác mẫu đến 0.001g. Sấy chén sấy và nắp đậy (m0) (không đậy nắp lên chén) và làm nguội trong bình hút ẩm. Dùng cân cân chính xác 5g 0.25g mẫu đã được trộn đều và chuyển vào chén, giảm tối đa sự tiếp xúc với khơng khí. Đậy nắp và cân ngay để xác định khối lượng phần mẫu thử và chén (m1). Đặt chén sấy chứa mẫu và nắp (không đậy nắp lên đĩa) vào tủ sấy đã được làm nóng trước đến 1100C, sấy trong 2 giờ. Kết thúc thời gian sấy, đậy nhanh nắp chén và đặt ngay vào bình hút ẩm. Để phần mẫu thử nguội đến nhiệt độ phịng trong bình hút ẩm từ 30 phút đến 45 phút. Khi chén nguội đến nhiệt độ phòng, cân chén chứa mẫu và nắp (m2) trong vòng 2 phút kể từ khi lấy ra từ bình hút ẩm. Tiến hành ít nhất 2 phép xác định trên cùng 1 mẫu thử.
+ Tính kết quả:
Độ ẩm được biểu thị theo phần trăm khối lượng và được tính theo cơng thức sau:
%Ẩm Trong đó:
mo : Khối lượng của chén và nắp đã được sấy (g)
m1 :Khối lượng của chén cùng với phần mẫu thử và nắp trước khi sấy (g) m2 : Khối lượng của chén cùng với phần mẫu thử và nắp sau khi sấy (g).
2.3.6.2. Xác định độ tro – TCVN 9939:2013 + Nguyên tắc:
Phương pháp dùng tủ sấy để xác định hàm lượng tro trong tinh bột. Nung mẫu thử ở nhiệt độ 900oC đến khi phần cịn lại hồn tồn khơng cịn cacbon. Hàm lượng tro được biểu thị theo phần trăm khối lượng sản phẩm hoặc phần trăm khối lượng tính theo chất khơ.
+ Quy trình:
Làm sạch đĩa nung, sau đó cho chén nung vào lò nung và nung trong 30ph ở 900oC 25oC. Để nguội đến nhiệt độ phịng trong bình hút ẩm rồi cân chính xác đến 0.0001g.
Cân nhanh từ 2g đến 10g mẫu, chính xác đến 0.001g tùy thuộc vào hàm lượng tro dự kiến trong mẫu. Chuyển mẫu vào chén nhưng không nén chặt.
Đốt sơ bộ chén đựng mẫu một cách cẩn thận. Đốt các chất bay hơi tạo thành để tránh tự cháy mà có thể làm tăng thất thốt mẫu do bị bắn ra khỏi chén. Ngay khi tắt lửa, đặt chén vào lò nung, tăng nhiệt độ đến 900oC 25oC và duy trì nhiệt độ này cho đến khi hết cacbon, thường khoảng 1h là đủ. Đặt chén cùng với tro vào bình hút ẩm, để nguội đến nhiệt phịng rồi cân chính xác đến 0.0001g. Tiến hành ít nhất hai phép thử xác định trên cùng một mẫu thử.
+ Tính kết quả:
Hàm lượng tro tính theo phần trăm khối lượng sản phẩm, được tính bằng cơng thức:
Trong đó:
m1 : Khối lượng mẫu và chén nung sau khi nung (g) mo : Khối lượng chén sau khi nung (g)
mm : Khối lượng phần mẫu thử (g).
2.3.6.3. Xác định hàm lượng xơ – TCVN 5103:1990 + Nguyên tắc:
Sau khi nghiền và khử chất béo, đun sôi mẫu trong dung dịch acid sunfuric ở nồng độ chuẩn, tiến hành tách và rửa cặn khơng hồ tan.
Đun sơi tiếp cặn cịn lại với dung dịch natri hydroxit ở nồng độ chuẩn, sau đó tiến hành tách, rửa, làm khơ và cân cặn khơng tan cịn lại, tiến hành xác định.
+ Quy trình:
Chuyển mẫu đã loại các chất béo vào bình cầu cất, cho vào bình 200mL H2SO4
1.5% đã đun sôi sẵn, lắp ống sinh hàn ngược vào bình cầu, đun trên bếp cách thủy sơi trong 30 phút lắc ln để tránh mẫu bị cacbon hóa, lọc mẫu đã thủy phân acid (dùng máy li tâm, bộ lọc chân khơng). Rửa phần khơng hịa tan nhiều lần bằng nước cất đun sôi cho đến khi nước rửa khơng cịn acid, thử bằng giấy đo pH.
Chuyển tồn bộ bã khơng tan đã thủy phân acid và rửa sạch vào bình cầu cất, tráng kĩ giấy lọc hoặc ống chứa bã bằng nước cất đun sôi, lượng nước tráng tổng cộng là 100mL. Thêm 200mL dung dịch NaOH 1.5% đã đun sơi vào bình, lắp ống sinh hàn, đun sôi và giữ trên bếp cách thủy sôi 30 phút. Lọc lấy xơ bã khơng hịa tan, rửa sạch bằng nước sơi đến trung tính thử bằng giấy đo pH. Để ráo nước bằng cồn 96o hai lần, mỗi lần khoảng 5mL.
Chuyển toàn bộ xơ bã vào một chén nung đã sấy khơ cân bì. Sấy chén có xơ bã trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC trong 1 giờ, để nguội cân. Sấy lại cho đễn khối lượng không đổi.
Chuyển chén nung vào lò nung đến tro trắng làm nguội trong bình hút ẩm, cân. Nung đến khối lượng khơng đổi.
+ Tính kết quả:
Hàm lượng xơ thơ (X) được tính bằng % theo cơng thức:
Trong đó:
m1: Khối lượng chén nung và xơ bã sau sấy (g) m2: Khối lượng chén nung và tro sau khi nung (g) m : Khối lượng mẫu (g).
2.3.6.4. Xác định hàm lượng protein tổng –TCVN 9934:2013 + Chuyển hóa Nitơ về dạng muối (NH4)2SO4:
Cân khoảng 2.00 gam mẫu đã nghiền mịn và đồng nhất vào bình phá mẫu có chứa sẵn 2.5g hỗn hợp xúc tác (CuSO4 : K2SO4 = 1:10). Cẩn thận cho thêm 1ml HClO4 và 10ml H2SO4 đặc vào bình phá mẫu kjendalh, đặt một phễu thủy tinh lên miệng của bình phá mẫu. Tiến hành vơ cơ hóa mẫu cho đến khi dung dịch thu được có màu vàng hoặc xanh trong suốt. Lấy mẫu ra và để nguội.
+ Chuẩn bị hệ thống cất đạm:
Chuẩn bị bình hấp thụ chứa 20ml H3BO3 bão hịa (40g H3BO3 hịa tan trong 1 lít nước cất) + 5 giọt chỉ thi Tashiro, dùng NaOH 0.1N chỉnh đến pH = 5.5 (dung dịch có màu xám bẩn). Lắp ráp hệ thống cất đạm, kiểm tra độ kín của hệ thống và nước hoàn lưu.
+ Chưng cất và chuẩn độ:
Chuyển tồn bộ mẫu vào bình chưng cất qua phễu, dùng nước cất tráng 3 lần, mỗi lần 5mL. Thêm 20mL NaOH 40%, khi cịn khoảng 2ml thì khóa phễu lại. Thêm 50mL nước cất, mở khóa cho dung dịch xuống, cịn 5mL thì khóa lại. Tiến hành chưng cất cho đến khi hết NH3 thì dừng (thử bằng giấy pH). Hạ bình ngưng tụ xuống, dùng bình tia rửa đi ống sinh hàn, thu nước rửa vào bình hứng. Chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn HCl 0.1N đến khi dung dịch chuyển từ màu xanh lục sang tím nhạt. Ghi thể tích tiêu tốn.
Hàm lượng protein tổng (P) được tính theo cơng thức:
Trong đó: N: Nồng độ đương lượng của HCl (N) V: Thể tích HCl chuẩn độ (mL)
0.014: Đương lượng của nitrogen 6.25: Hệ số chuyển %N thành %P mm : Khối lượng mẫu tinh bột (g).
2.3.6.5. Xác định hàm lượng nhóm carboxyl [51] + Nguyên tắc:
Tinh bột có chứa carboxyl được cân bằng với acid vô cơ để chuyển các muối carboxyl thành dạng acid. Các cation và acid dư được loại bỏ bằng cách rửa với nước. Mẫu đã rửa được hồ hóa trong nước và được chuẩn độ bằng dung dịch kiềm chuẩn.
+ Quy trình:
Mẫu tinh bột (2g) được hòa tan trong 25mL dung dịch HCl 0.1N và khuấy đều trong 30 phút trên máy khuấy từ. Huyền phù tinh bột được lọc hút chân không qua phễu lọc thuỷ tinh xốp dung tích 150mL và rửa bằng 400mL nước cất. Bánh lọc tinh bột được chuyển nguyên lượng vào cốc thuỷ tinh 500mL và thêm nước cất đến thể tích 300mL. Huyền phù tinh bột được gia nhiệt trong bể điều nhiệt và khuấy liên tục trong 15 phút để hồ hố hồn tồn. Dung dịch hồ tinh bột nóng được điều chỉnh đến thể tích 450mL bằng nước cất và chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn NaOH 0.01N tới pH 8.3 với chỉ thị phenolphtalein. Mẫu trắng được thực hiện đối với tinh bột khơng biến tính.
+ Tính kết quả:
COOH/100GU=(VS−Vb)×M×0.045×100
W
Trong đó:
Vs : Thể tích HCl tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu thực (mL) Vb : Thể tích HCl tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng (mL) M : Nồng độ NaOH (N)
W : Khối lượng mẫu (g).
2.3.6.6. Xác định hàm lượng nhóm carbonyl [51] + Nguyên tắc:
Chuyển hóa nhóm carbonyl về nhóm oxime bằng phản ứng với hydroxyamine tự do được giải phóng trong hỗn hợp hydroxylamine hydroclorua và NaOH. Chuẩn độ lượng kiềm dư bằng dung dịch HCl.
+ Quy trình:
Cân 4g tinh bột được hịa tan trong cốc 500mL chứa 100mL nước cất. Gia nhiệt tới 40oC và điều chỉnh pH về 3.2 bằng dung dịch HCl 0.1N và thêm 15mL dung dịch hydroxylamine. Cốc được đậy kín và đặt trong bể điều nhiệt ở 40oC trong 4 giờ có
khuấy nhẹ. Hydroxylamine dư được xác định bằng cách chuẩn độ nhanh hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch chuẩn HCl 0.1N tới pH = 3.2 với chỉ thị bromphenol xanh. Mẫu trắng chỉ chứa hydroxylamin được làm tương tự như mẫu thực.
Thuốc thử hydroxylamine được pha bằng cách hoà tan 25g hydroxylamin hydroclorua trong 100mL dung dịch NaOH 0.5N trước khi định mức bằng nước cất tới thể tích 500mL.
+ Tính kết quả:
CO/100GU=(Vb−VS)×M×0.028×100
W
Trong đó:
Vs : Thể tích HCl tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu thực (mL) Vb : Thể tích HCl tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng (mL) M : Nồng độ HCl (N)
W : Khối lượng mẫu (g).
2.4. Phương pháp xác đặc tính hóa lý của tinh bột2.4.1. Xác định khả năng trương nở và độ hòa tan [52] 2.4.1. Xác định khả năng trương nở và độ hịa tan [52]
Cân 0.5g tinh bột vào bình định mức và dùng nước cất định mức tới 10mL, đưa vào nồi cách thuỷ ở nhiệt độ 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC trong 30 phút, 5 phút lắc một lần. Sau đó đi ly tâm (tốc độ 1600 vòng/phút trong 15 phút), thu được hai phần: tinh bột khơng hồ tan và nước dịch, đem sấy khô xác định khả năng trương nở và độ hoà tan của tinh bột.
- Khả năng trương nở (g/g mẫu) của tinh bột tính theo cơng thức:
Trong đó: m1 : Khối lượng tinh bột sau ly tâm (g)
m2 : Khối lượng tinh bột sau ly tâm đã sấy khơ (g). - Độ hồ tan (%) tính theo cơng thức:
Trong đó: m3 : Khối lượng chất hoà tan trong dung dịch sau ly tâm đem sấy (g)
m: Khối lượng mẫu thử (g).
2.4.2. Xác định độ nhớt
Hồ tan 10g tinh bột khơ vào nước cất sao cho tổng khối lượng nước và tinh bột là 200g. Đun sôi hỗn hợp trong 10 phút để hồ hố hồn tồn. Thực hiện phép đo độ nhớt bằng nhớt kế quay Brookfield (Mỹ) với tốc độ khuấy 100 rpm và quá trình hạ nhiệt độ từ 80oC đến 30oC [53].
2.4.3. Vi ảnh của các hạt tinh bột
Vi ảnh các hạt tinh bột xác định bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM-Scaning Electronic Microscope trên thiết bị JSM-5412V (Japan).
2.4.4. Xác định phân bố kích thước hạt của tinh bột
Phân bố kích thước hạt được thực hiện bằng phương pháp tán xạ laser trên thiết bị Horiba LA-950 tại Phịng Cơng nghệ hố dầu, Trường đại học Bách khoa Hà Nội và trên thiết bị Horiba LA-920 tại trường đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh.