1. Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong môn học:
3.1. Vi sinh vật phân giải cellulose
3.1.1. Nguyên tắc
- Cellulose (C6H10O5)n là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật. Hằng năm có một khối lượng lớn cellulose được đưa vào đất, mặc dù là chất cao phân tử, khá bền, chúng vẫn bị phân giải dưới ảnh hưởng của một số vi sinh vật trong điều kiện kị khí lẫn hiếu khí, môi trường kiềm hay môi trường axit, độ ẩm cao thấp ở nhiệt độ khác nhau. - Hoạt động phân giải cellulose có ảnh hưởng lớn đến độ phì nhiêu của đất và có ý nghĩa lớn trong quá trình xử lý môi trường.
- Quá trình phân giải cellulose xảy ra nhờ tác dụng của enzyme cellulose. Dưới tác dụng của enzyme này, cellulose bị phân giải thành cellulobiose (C12H22O11) lại tạo thành glucose (C6H12O6) nhờ tác dụng của enzyme celloblase.
- Các vi sinh vật tham gia quá trình phân giải cellulose bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm nhưng trong đó niêm vi khuẩn đóng vai trò quan trọng.
3.1.2. Kết quả - Kết quả phân tích : - Kết quả phân tích : Tính kết quả: Số tế bào/g = N x x n x K=26 x x 10000 x 1= 26.105 (tế bào/g) N : Số khuẩn lạc trung bình trong 1 petri (với N = 26 tế bào)
V : thể tích mẫu cấy (trong trường hợp này là 0,1)
n : số nghịch đảo của nồng độ pha loãng (nồng độ pha loãng ở đây là 10-4n=10000) K: hệ số khô kiệt của mẫu (trong trường hợp này K=1)
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 29
Khuẩn lạc Kích thước Màu sắc Mức độ phân giải Số khuẩn lạc
Vi khuẩn đỏ 10-20mm Đỏ 5/10 13 Vi khuẩn trắng 3-5mm Trắng 2/10 5 Vi nấm 5-10mm Đen 3/10 8
- Nhóm chiếm ưu thế là vi khuẩn màu đỏ - Lấy vi khuẩn trắng cấy ria ta được
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 30
Hình: Vi sinh vật phân giải cellulose ở môi trường Hutchinson
Hình: vi nấm cellulose
Nấm tập trung thành từng nhóm nhỏ, mỗi chấm là một khuẩn lạc Màu sắc: xanh,đen tầm 0,5-2mm
Hình dạng: chấm tròn nhỏ
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 31
3.1.3. Nhận xét:
- Tùy vào môi trường mà thời gian xuất hiện khuẩn lạc nhanh hay lâu.
- Khi đặt giấy lọc vào hộp petri phải ép sát giấy lọc vào môi trường để tận dụng hết bề mặt giấy và tránh vi khuẩn khác loài mọc lan vào giấy .
- Lúc cấy ria phải thao tác phải nhanh, chính xác, thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh sự nhiễm trùng từ môi trường bên ngoài.
3.2. Vi sinh vật phân giải phosphor 3.2.1. Nguyên tắc 3.2.1. Nguyên tắc
- Các vi sinh vật đảm nhận chức năng chuyển hoá phosphor vô cơ thành dạng hoà tan có thể là vi khuẩn lưu huỳnh, vi khuẩn nitrat hoá hoặc các laoị vi khuẩn sinh axit lên men nhiều chất khác nhau.
- Để xác định số lượng vi khuẩn này, người ta thường dung môi trường glucose và muối phospho khó tan, thường dung Ca3(PO4)2 . Do kết quả làm tan phospho mà xung quanh khuẩn lạc sẽ hình thành những vòng trong suốt.
3.2.2. Kết quả
Nồng độ 10-2 Nồng độ 10-3
- Nồng độ pha loãng 10-2: khuẩn lạc mọc dày trên mặt thạch, không đếm được. - Nồng độ pha loãng 10-3: gồm 76 khuẩn lạc, khuẩn lạc có màu trắng xung quanh có những vòng phân giải trong suốt .
- Kết quả phân tích : Tính kết quả:
Số tế bào/g = N x
x n x K=76 x
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 32 N : Số khuẩn lạc trung bình trong 1 petri (với N = 26 tế bào)
V : thể tích mẫu cấy (trong trường hợp này là 0,1) n : số nghịch đảo của nồng độ pha loãng
K: hệ số khô kiệt của mẫu (trong trường hợp này K=1) - Hình ảnh vi khuẩn phân giải cellulose, mô tả chi tiết
3.2.3. Nhận xét:
- Khi đổ thạch vào hộp petri phải khử trùng vùng xung quanh và tay để tránh nhiễm vi sinh vật vào môi trường thạch.Khi tiến hành đổ thạch phải thực hiện trong phạm vi khử khuẩn của đèn cồn.
- Ghi nhãn đúng môi trường và đúng nồng độ pha loãng tránh gây lẫn lộn.
- Do thí nghiệm của nhóm không đạt kết quả, nên có sử dụng kết quả của một số nhóm khác để hoàn thiện bài báo cáo.
3.3. Vi khuẩn Nitrat hoá, nitrit hoá và vi khuẩn phản nitrat hoá 3.3.1. Nguyên tắc 3.3.1. Nguyên tắc
- Quá trình nitrit hoá
NH4+ dưới tác dụng của một số vi sinh vật tự dưỡng hoá năng đặc biệt được oxy hoá để biến thành NO2- gọi là quá trình nitrit hoá. NO2- sẽ tác dụng với dung dịch Griss I và Griss II sẽ tạo thành hợp chất màu hồng.
- Quá trình nitrat
NH4+ dưới tác dụng của một số vi sinh vật tự dưỡng hoá năng đặc biệt được oxy hoá để biến thành NO3- gọi là quá trình nitrat hoá. Quá trình này gồm 2 giai đoạn: giai đoạn nitrit hoá tạo sản phẩm nitrit NO2- và giai đoạn nitrat hoá với sản phẩm là NO3- . Xác định sự hiện diện của NO3- bằng cách cho dung dịch phản ứng diphenylamine, nitrat sẽ phản ứng với diphenylamine tạo ra Sulfonylindiphenyamine và dung dich có màu xanh.
- Quá trình phản nitrat hoá.
Là quá trình khử NO3- qua nhiều giai đoạn và cuối cùng tạo ra nitơ phân tử dưới tác dụng của vi sinh vật. Quá trình xảy ra trong môi trường kị khí. Định tính sự có mặt của nitrat, nitrit như trong phần nitrat hoá, sự tạo ra của nitơ phân tử thể hiện sự hình thành các bọt khí trong môi trường nuôi cấy.
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 33
3.3.2. Kết quả
3.3.2.1. Vi khuẩn amon trong môi trường lỏng:
- Quan sát và ghi nhận các đặc điểm sau:
Sự đục môi trường
Sự tạo bông, cặn
Sự nổi váng trên bề mặt - Phản ứng sinh hoá:
Sự biến đổi màu sắc của giấy thử pH: giá trị pH
Sự biến đổi màu của giấy lọc thấm acetate chì
So sánh mẫu đối chứng
Độ pha loãng Đục môi trường Tạo bông Tạo cặn pH
Màu giấy lọc tẩm acetate Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm Trước Sau
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 34
Vi khuẩn Amon hoá Sự đổi màu của giấy pH
- Sau vài ngày,trong quá trình nuôi cấy không ngừng sinh ra bọt khí và trên bề mặt môi trường có một lớp bọt khí. Chứng tỏ có quá trình chuyển hóa NO3-
và sinh ra khí N2.
3.3.2.2. Vi khuẩn nitrat hoá:
- Phản ứng định tính nitrit:
Dùng ống hút lấy 0,1 ml dung dịch môi trường cho vào ống nghiệm vô trùng. Nhỏ 1 giọt dung dịch Griess I, Griess II : màu hồng
- Chọn ống nghiệm dương tính làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi.
- Mô tả,so sánh các hình thái tế bào vi khuẩn quan sát được về: hình dạng,khả năng di động, khả năng tạo tập đoàn khuẩn keo.
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 35
Hình: Sự đổi màu của vi khuẩn Nitrat
3.3.2.3. Vi khuẩn phản Nitrat hoá:
3.3.3. Nhận xét:
- Ở quá trình phản nitrat hóa : NO3- được khử đến N2O và N2. Sự giải phóng N2 là sản phẩm ưu thế của quá trình phản nitrat. Vì N2 hòa tan ít trong nước,do đó chúng có
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 36 khuynh hướng thoát ra ngoài như các bong bóng nổi lên trên.Nhờ có lớp dầu paraffin trên bề mặt môi trường nên không khí bên ngoài không vào được và nito bên rong môi trường cũng không thoát ra ngoài được. Trong quá trình thí nghiệm cần thao tác cẩn thận tránh để không khí bên ngoài vào.
- Ở quá trình nitrat hóa: sự đổi màu từ trắng sang hồng chứng tỏ cường độ hoạt động của vi khuẩn mạnh.
3.4. E.coli,Coliform 3.4.1. Nguyên tắc 3.4.1. Nguyên tắc
- Ngoài phương pháp đếm khuẩn lạc, số lượng coliforms, coliforms chịu nhiệt, coliforms phân và E.coli trong mẫu được xác định bằng phương pháp MPN (most probable
number).
- Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy nồng độ thập phân; 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm có môi trường thích hợp có ống Durham bẫy khí. Mỗi nồng độ pha loãng ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. - Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống nghiệm, đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu.
3.4.2. Kết quả
Nồng độ Mẫu Nồng độ 10-1 Nồng độ 10-2
Ống 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Kết quả + + + + + + + + +
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 37 Nồng độ Mẫu Nồng độ 10-1 Nồng độ 10-2 Ống 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Kết quả + + + + + + + + + 3 3 3 Hình ảnh
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 38 Hình ảnh
E.coli
Do mẫu bị nhiễm vi sinh vật nên không có kết quả và hình ảnh quan sát dưới kính hiển vi
Coliform
Làm tiêu bản và hình ảnh quan sát được dưới kính hiển vi
Hình: nhuộm đơn Coliform
3.5. Vi sinh vật trong xử lý nước thải: 3.5.1. Nguyên tắc 3.5.1. Nguyên tắc
3.5.1.1. Nguyên tắc xác định Clostridium
- Giống Clostridium là các vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí, sinh bào tử, phần lớn di động, có thể thuỷ giải saccharide và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng.
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 39 Những loài thuỷ giải saccharide có thể lên men các loại đường polysaccharide tạo thành acetic axid, butyric acid mùi rất khó chịu trong sản phẩm. Hầu hết các giống Clostridium thuộc nhóm ưa nhiệt vừa, tuyy nhiên có một số loài thuộc nhóm ưa nhiệt và một số loài khác thuộc nhóm ưa lạnh.
- Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có chứa ferri ammonium citrate và disodium sulphite, ủ ở 37oC trong 1-2 ngày. Nếu nghi ngờ có
Clostridium ưa nhiệt có thể ủ thêm ở 50oC. Trên môi trường này các khuẩn lạc Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphite (S2-
) và ion (Fe2+) có trong môi trường.
3.5.1.2. Nguyên tắc xác định Streptococcus phân
- Streptococcus phân (Feacal Streptococcus) là các liên cầu khuẩn, có nguồn gốc từ phân, có hình cầu hay hình oval kéo dài, gram dương, thường tụ tập thành từng đôi hay từng chuỗi, không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhầy. Hầu hết các ;oài này sống hiếu khí tuỳ ý nhưng phát triển tốt trong điều kiện kị khí, tiết bacteriocin trong quá trình tang trưởng và có thể ức chế sự tang trưởng của các vi khuẩn khác.
Streptococcus được dùng để đánh giá mức độ ô nhiễm phân của môi trường nước. - Có thể xác định Septoccus phân bằng phương pháp đếm khuẩn lạc hoặc phương pháp MPN.
- Phương pháp đếm khuẩn lạc
Mẫu được cấy trên bề mặt môi trường chọn lọc, sau khi ủ đếm khuẩn lạc đặc trưng và khẳng định các khuẩn lạc đã đếm bằng các thử nghiệm sinh hoá. Trong trường hợp nghi ngờ có sự hiện diện của Streptococcus phân nhưng có thể bị tổn thương, tiến hành hồi phục các vi khuẩn này bằng cách cấy mẫu vào trong môi trường không chọn lọc, ủ ở 37oC trong 2 giờ, sau đó phủ lên một lớp môi trường chọn lọc, các đĩa môi tường sau khi cấy được ủ ở 44oC trong khoảng 48 giờ.
- Phương pháp MPN
Dịch mẫu được cấy vào môi trường canh Azide Glucose. Stretococcus phân có khả năng sinh trưởng trong môi trường này, lên men glucose sinh acid làm biến đổi màu của chất chỉ thị pH trong môi trường. Tất cả các ống cho kết quả dương tính sẽ được cấy tiếp sang môi trường khẳng khác. Môi trường khẳng định được sử dụng Bile Esculine Agar.
Streptococcus phân thuỷ phân esculine trong môi trường tạo ra sản phẩm cuối cùng là 6,7-hydroxycoumarin, chất này kết hợp với Fe3+ tạo thành hợp chất có màu nâu đen
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 40 khuếch tán vào môi trường. Ngoài ra, việc khẳng định còn được thực hiện bằng thử nghiệm bằng thử nghiệm catalase.
3.5.2. Kết quả
- Mỗi mẫu nước trong bề aerotank, SBR thực hiện làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi.
Mẫu ban đầu 2h
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 41 8h - Chụp hình vi sinh vật Mẫu 0h Mẫu 4h Mẫu 2h Mẫu 8h 3.5.3. Nhận xét
- Mẫu nước thải ban đầu rất ô nhiễm, mẫu nước có màu đen, có mùi hôi kho chịu - Sau khi cho sục khi thì mẫu nước trong hơn , cặn lơ lửng ít và lắng xuống đáy như hình 2
- Tiếp tục làm như vậy ta được hình 3,4,5 màu nước trong, không có mùi, ít cặn lơ lửng, các bông cặn lớn dần và bị lắng xuống thành bùn
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 42 - Từ đó cho thấy, khi cho sục khí vào thì xuất hiện các vi sinh vật trong nước thải hoạt động, và nhờ đó mà chất lượng nước đã thay đổi
- Nước thải càng sục khí lâu thì càng có nhiều vi sinh vật và kích thước lớn - Có ít vi sinh vật trong mẫu quan sát.
- Có những vi sinh vật hình bầu dục có thể di chuyển nên không chụp lại được hình ảnh của chúng
- Máy ảnh chụp không rõ nét
- Kính hiển vi cũ nên hình ảnh soi được không đẹp
- Không thể xác định được số lượng vi sinh vật và tên của chúng.
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Sau môn học sinh viên nắm được các bước tiến hành của từng thí nghiệm. Có kinh nghiệm trong việc thưc hành.
Nội dung bài liên kết với nhau dễ hiểu.
Nội dung thí nghiệm các phương pháp và các bước tiến hành được trình bày kĩ.
Các thiết bị thí nghiệm có một số khuyết điểm rõ ràng. Nhiều bài không tiến hành được các thí nghiệm nghiên cứu và kiến thức chuyên môn còn hạng hẹp các nhận định trong bài chỉ mang tính chất dự đoán, định tính mà không có kết quả chính xác. Do đó kết quả nhóm đưa ra chưa chuẩn xác. Rất mong được sự góp ý sữa chữa của thầy để kiến thức của sinh chúng tôi thêm hoàn thiện.
Tuy kết quả chưa cao nhưng chúng tôi biết cách thao tác thí nghiệm và kiểm nghiệm kiến thức
4.2. Kiến nghị
Nếu trường có đầy đủ các dụng cụ thí nghiệm, phòng học bộ môn thì sinh viên sẽ suy nghĩ và làm việc độc lập nhằm phát triển hơn về năng lực cá nhân của sinh viên
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 43
4.3. Bài học kinh nghiệm
Trong quá trình rèn luyện khả năng làm thí nghiệm thực hành nhóm đã rút ra một số kinh nghiệm sau:
• Khi làm thí nghiệm phải nắm được mục đích thí nghiệm.
• Nắm chắc các bước tiến hành thí nghiệm. Thao tác thí nghiệm cẩn thận chính xác. Tránh tình trạng làm đi làm lại nhiều lần làm mất tính thuyết phục.
• Dự đoán kết quả trước khi làm thí nghiệm để sau đó tiến hành thí ngiệm rồi so sánh kết quả.
• Sinh viên tự biết bố trí thí nghiệm và thấy được kết quả làm ra.
• Sinh viên tự biết khám phá kiến thức, tự tìm kiến thức trong tâm cho mình để ghi nhớ để tránh việc ghi nhớ máy móc mà hiểu sâu về vấn đề hơn, khả năng diễn đạt rõ ràng.
(Hình ảnh các thành viên trong nhóm)
Họ và tên Hình ảnh
Ngô Thái Bảo
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 44 Trần Thiên Ân
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 45