Chuẩn bị hỗn hợp nhồi cột như trên. Bịt đáy cột và nạp cột nhu trên. Sau đó gắn piston lên trên cột, bình chứa dung môi, nén, mở đáy cột cho dung môi đi ra.
3.4.3. Chuẩn bị mẫu- Đƣa mẫu lên cột.
Đưa mẫu vào : bước này khá phức tạp vì áp suất đầu vào rất cao.
Thời gian lưu của mẫu (retention time): Là khoảng thời gian từ lúc đưa mẫu vào đến khi đỉnh (peak) của hiển thị rõ nét. Khoảng thời gian này bị chi phối bởi các yếu tố : + Áp suất đầu vào.
+ Tính chất của pha tĩnh (hợp chất, kích thước hạt). + Thành phần dung môi.
overload trong sắc kí: khi lượng mẫu nạp quá lớn và điều đó làm giảm hiệu năng của cột, có 2 loại: nạp vượt quá thể tích (volume overload) và nạp vượt quá khối/ nồng độ (mass overload); có thể do mặc định hoặc có chủ ý trong sắc kí điều chế.
+ Volume overload dẫn tới mở rộng peak, nhưng sự mở rộng này đối xứng vì thế hình dạng peak ở trước và sau không bị méo/ biến dạng. Trong sắc kí chế hóa thể tích mẫu có thể tăng cho tới khi 2 peak của 2 chất được rửa giải gần nhau nhất chạm nhau, và thể tích mẫu lúc này là tối ưu. Trong sắc kí phân tích thì không chấp nhận chuyện này, không dùng bất cứ cách nạp mẫu overload nào, ngoại trừ trong những trường hợp khả dĩ có thể làm tăng khả năng phân tích chất dạng vết.
+ Mass overload thì chắc chắn làm cho peak bị biến dạng; mức nồng độ chất cần tách trong pha tĩnh sẽ ở trong vùng không tuyến tính của đường đẳng nhiệt hấp phụ. Nếu đường đẳng nhiệt hấp phụ lõm về phía trục biểu thị nồng độ trong pha động thì ở nồng độ cao của chất tan hệ số phân bố hiệu dụng sẽ thấp hơn. Vì vậy phần có nồng độ chất tan cao hơn sẽ di chuyển trong cột nhanh hơn phần có nồng độ thấp, và peak sẽ bị méo với phía trước nhọn và đuôi bị nghiêng/ thoải. Thời gian lưu nói chung sẽ giảm. Tuy nhiên nếu đường đẳng nhiệt lõm về phía trục biểu diễn nồng độ trong pha tĩnh thì ở nồng độ cao của chất tan, hệ số phân bố hiệu dụng sẽ lớn hơn. Và vì thế phần có nồng độ cao hơn sẽ di chuyển chậm hơn phần có nồng độ thấp trong cột, peak sẽ bị méo với phía trước nghiêng và đuôi nhọn; trong trường hợp này thời gian lưu nói chung sẽ giảm khi khối mẫu tăng.
3.4.4. Với pha đảo (Reverse Phase HPLC Basics for LC/MS).
Mẫu không nên hòa tan trong 1 dung môi hữu cơ nếu không nó có thể không gắn lên pha tĩnh được. Mẫu cũng không nên tan trong dung dịch chứa chất tẩy, một vài chất tẩy có thể gắn lên cột pha đảo và làm thay đổi tính chất cột không thuận nghịch. Hơn nữa chất tẩy được ion hóa ưu tiên khi bị tác động của dòng electron trong đầu dò khối phổ, làm giảm khả năng phát hiện hay ức chế sự ion hóa chất phân tích.
Không 1 nghiên cứu nào về sắc kí gọi là hoàn chỉnh nếu thiếu phần nghiên cứu về nhiệt độ. Nhiệt độ xung quanh ảnh hưởng thời gian lưu. Nhiệt độ chạy thường là 40°C. Để ổn định nhiệt độ cho cột, ta có thể dùng jacket (áo giữ nhiệt), buồng ổn nhiệt,..
Có thể dùng nhiệt độ để tác động tới quá trình chiết tách. Nói chung nhiệt độ cao hơn thì tốt hơn, peak sẽ nhọn hơn và rửa giải sớm hơn. Tuy vậy nhiệt độ cao làm giảm tuổi thọ cột và nhiều cột không chịu được nhiệt độ quá 60°C.
3.5. Lựa chọn dung môi- Thay đổi dung môi.
Pha thuận thường được chạy với dung môi hữu cơ, thường là hexane, heptane, cyclohexane hay halocarbon như DCM, Cloroform. Pha động rửa giải thường là 1 dung môi thân nước, như nước, ester. Acid hữu cơ thường thêm vào để giảm thiểu hiệu ứng trao đổi ion do những nhóm silanol.
Rửa giải đẳng dòng với hỗn hợp butanol, acid acetiic và nước là giao thức chuẩn cho sự tách giải các acid amin và 1 hỗn hợp methanol, cloroform, nước hữu dụng cho hợp chất hữu cơ nói chung. Peptide dễ dàng được tinh chế bằng rửa giải kiểu gradient trên silica pha thuận, tăng dần từ acetonitrile tới pha động có nước. Kĩ thuật này đặc biệt hiệu quả với những peptide rất phân cực khó phân lập trên sắc kí pha đảo.
Pha đảo hoạt động trong môi trường đệm thân nước, nơi hấp phụ kị nước giữa chất phân tích và pha tĩnh bị xáo trộn bới sự tăng dần nồng độ 1 dung môi hữu cơ có thể hỏa lẫn. Ứng dụng phổ biến của HPLC pha đảo là trong tinh chế peptides và protein, trong đó chất phân tích thường được giả hấp bởi sự rửa giải gradient. Đệm chạy thân nước phổ biến nhất thường là nước chứa hàm lượng thấp của axit trifluoroacetic (thường là 0,1% v / v) và các pha động rửa giải thường là acetonitrile- chất điều chỉnh độ phân cực- chứa axít trifluoroacetic.
Các trifluoroacetic axit phục vụ hai mục đích: trước hết, nó tạo một cặp ion mạnh với chất phân tích, như vậy chống lại việc trao đổi cation với bất kỳ nhóm silanol tự do nào trên giá mang silica; và thứ nhì, với vai trò các cặp ion, nó làm giảm sự thay đôi cấu
nhiều phân tử khác. Các đệm acid khác như phosphate, acetate and hydrochloride cũng thường được dùng. Ethanol, methanol, tetrahydrofuran, pro-pionitrile và propan-2-ol cũng thường được dùng với vai trò chất điều chỉnh độ phân cực, nhưng chúng không tốt bằng acetonitrile.
Silica pha đảo không ổn định trong môi trường kiềm do sự mất các gốc ankyl và sự hòa tan của silica khi hoạt động lâu ở pH cao. Với pha tĩnh polymer lỗ lớn ổn định ở pH cao (macroporous polymeric stationary phases) có thể mở rộng khoảng pH hoạt động của pha đảo trong khoảng 1-14. Pha đảo polymer thường dùng nhất là loại polymer trùng hợp từ styrene và divinyl benzene. Tính kị nước của pha tĩnh này là do mạch polymer dài và vòng benzene, vì thế quá trình rửa giải dự đoán sẽ khác với pha tĩnh silica C18 chẳng hạn. Thực tế, trên dữ liệu rửa giải nhiều chất, trình tự rửa giải và thời gian rửa giải quan sát được trên pha tĩnh polymer chất lượng cao thường tương tự kết quả thu được từ pha tĩnh silica chất lượng cao.
Một số bộ phận phát hiện:
-LC Detectors Based on Refractive Index Measurement
The Refractive Index Detector The Angle of Deviation Method The Fresnel Method
The Christiansen Effect Detector The Interferometer Detector The Thermal Lens Detector The Dielectric Constant Detector
-The UV Detectors
The UV Absorption Detectors The Fixed Wavelength UV Detector The Multi–Wavelength UV Detector
The Multi–Wavelength Dispersive UV Detector The Diode Array Detector
The Fluorescence Detector
The Single Wavelength Excitation Fluorescence Detector The Multi Wavelength Fluorescence Detector
-Transport Detectors
The Moving Wire Detector The Chain Detector
The Modified Moving Wire Detector The Disc Detector
-The Evaporative Light Scattering Detector
The Multiple Angle Laser Light Scattering (MALLS) Detector -The Electrical Conductivity Detector
-The Electrochemical Detector
Electrode Configurations Electrode Construction
Basic Electrochemical Detector Electronics The Multi–Electrode Array Detector
3.7. Các ứng dụng cụ thể.
Tinh chế taxol bằng sắc ký lỏng điều chế sử du ̣ng trong công nghiê ̣p : mô ̣t phương pháp đã được nghiên cứu phát triển để tinh chế taxol từ dịch ch iết cloroform thô của cây Taxus yunnanensis sử du ̣ng sắc ký lỏng điều chế công nghiê ̣p (IPLC) dựa trên pha tĩnh polymer (D956 resin). Sử dung hê ̣ thống thiết bi ̣ đơn (single-system apparatus), khoảng 5 kg di ̣ch chiết thô có thể được tải qua cô ̣t đầu tiên , và cuối cùng , qua 3 lần cha ̣y sắc ký , khoảng 50g taxol (99% tinh khiết) có thể thu được sau 155h, ko tốn bất kỳ dung môi hữu cơ nào. Sự thu hồi taxol đa ̣t trên 80%. Nhựa D956 đã cho thấy tính chon lo ̣c và khả năn g tách taxol cao hơn so với silicagel và C materials . Với hê ̣ thống này , viê ̣c áp dung chiết taxol trong công nghiê ̣p có thể thực hiê ̣n được . (Journal of Chromatography A, 813 (1998) 201–204 Purification of taxol by industrial preparative liquid chromatography, Xuefeng Yang*, Kailu Liu, Man Xie, Beijing Research Institute of Chemical Engineering and Metallurgy, P.O. Box 234, Beijing 101149, China, 1998)
Ứng dụng sắc ký lỏng điều chế xác định polyphenol từ lá chè xanh thứ phẩm. TS. Phùng Lan Hương.
PHẦN 4
MPLC ĐIỀU CHẾ 4.1. Tổng quan.
MPLC là buớc chuẩn bị cho HPLC. MPLC với áp suất và tỉ suất dòng chảy cao hơn, cho phép sử dụng cột C18 với kích thuớc hạt giảm để cho kết quả gần với hệ thống chuẩn bị HPLC.
4.2. So sánh ƣu nhƣợc điểm giữa MPLC và HPLC. 4.2.1. Chuyển đổi dung môi.
HPLC: chỉ dùng đuợc cấu hình để chạy sắc ký pha đảo và pha thuờng
MPLC: có tính linh hoạt và dễ chuyển đổi hệ thống dung môi giữa pha đảo và pha thường
4.2.2. Cột nạp mẫu rắn.
MPLC: cho phép sử dụng nhiều kỷ thuật nạp mẫu. Thuận lợi chính của MPLC về cơ chế tiêm mẫu là sự phục hồi mẫu cao. Hợp chất đuợc dễ dàng chuyển lên cột trong suốt thời gian nạp mẫu.
Có nhiều thuận lợi về tiêm mẫu lỏng. Nó giúp sử dụng tốt nhất khả năng tự động của hệ thống. Người sử dụng chỉ cần ấn nút Start và đi làm việc khác.
Hệ thống cân bằng cột, nạp cột, tái cân bằng cột mà không cần can thiệp khác. Ngoài ra MPLC cho phép hợp chẩt tan giới hạn trong trong pha động, có thể nạp dễ dàng mà không cần tiêm một luợng dung môi mạnh, có thể gây giảm hiệu suất cột.
Hệ thống HPLC yêu cầu hợp chất tan hoàn toàn, do đó cần một luợng dung môi mạnh gây giảm khả năng gắn ban đầu vào cột
Có nhiều chọn lựa chất hấp phụ:hợp chất nạp lên cột C18 có thể hấp phụ lên Celite,.. Ngoài ra còn có thể nạp thẳng lên cột làm sẵn. Vật liệu đuợc hoà tan trong dung
Hợp chất đuợc tách tinh khiết cao
Lọc dung môi không cần lọc hay khử khí dung môi, giúp tiết kiệm thời gian cho việc tinh khiết. Đặc biệt bóng khí không làm mất nguyên tố của hệ thống.
4.3. Ứng dụng.
Tinh khiết hợp chất chứa 5-5-benzyl-N-α-N-im-di-t-Boc-
L-His1 (hợp chất A), sử dụng cột C18, hệ dung môi 5-95% ACN:H2O, ở bước sóng 214nm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Laboratory Chromatography Guide, Angelo Talamona, Büchi Labortechnik AG. 2. Liquid Chromatography Column Theory, Raymond P. W. Scott, John Wiley &
Sons.
3. Preparative Chromatography, Book 12 Chrom-Ed Book Series, Raymond P. W. Scott.
4. Encyclopedia of chromatography Third Edition, Jack Cazes.
5. Preparative chromatography techniques Second edition “Applications in natural product isolation”, K.Hostettmann, A. Marston, M.Hostettmann, Springer.
6. Journal of Chromatography library volume 3 – Liquid column chromatography a survey of modern thechniques and applications, Z.Deyl, K.Macek and J.Janak, p.163.
7. A Practical Handbook of Preparative HPLC, Donald A. Wellings.
8. The Role of the Column in Preparative HPLC, Ronald E. Majors, Agilent Technologies, Wilmington, Delaware, USA.