Số đĩa lý thuyết

Một thông số dùng để so sánh khác là số đĩa lý thuyết N của cột

Công thức tính N có được dựa trên giả định rằng pic có hình dạng đường cong Gaussian. Để đơn giản tính toán, các pic được thừa nhận có hình dạng Gaussian.

Số N lớn tương ứng với cột tốt.

Khoảng cách lý thuyết cho một quá trình giải hấp phụ - hấp phụ là một đĩa lý thuyết do đó nó là thông số đại diện tốt nhất cho các thông số khác (kích thước pha hấp phụ, tốc độ dòng, chiều dài cột,…).

2.7.3. Chiều cao tƣơng ứng với một đĩa lý thuyết.

Để có thể so sánh các cột có chiều dài khác nhau, cần thiết phải tính chiều cao của đĩa lý thuyết H (H=L/N với L là chiều dài của cột)

2.7.4. Chiều cao đĩa lý thuyết đã làm giảm.

Nhằm so sánh các cột có kích cỡ khác nhau, thông số thích hợp nhất là chiều cao đã làm giảm h.

Trong một vài trường hợp, số đĩa lý thuyết phụ thuộc chặt chẽ và hoạt chất sử dụng để kiểm tra. Thông tin chính xác về chất thử và điều kiện thử cần phải được cung cấp.

2.7.5. Độ phân giải.

Độ phân giải mô tả mối liên hệ của 2 pic, đây là thông số đóng vai trò quan trọng trong việc phân lập một hỗn hợp các chất.

R = 2(tR2 – tR1)/(w1 + w2) = 1,177(tR2 – tR1)/(b0,5(1) + b0,5(2))

2.7.6. Thể tích chết.

Thể tích chết V0 được định nghĩa là khoảng trống trong cột sắc ký. V0 = tR . Fm (Fm là tốc độ phân phối hay lưu lượng dòng).

G. Helmchen và B.Glatz đã đề nghị một phương pháp khác để tính V0. Cột được làm đầy với một dung môi thứ nhất (tỉ trọng d1), đóng kín và cân (G1). Cột sau khi triển khai được phục hồi lại bằng một dung môi thứ hai (d2), cũng đóng kín và cân (G2). V0 được tính theo công thức:

V0 = (G2 – G1)/(d2 – d1)

Biết được V0 có thể tính toán được thời gian chết to. to = V0 / Fm

2.8. Phân lập kết quả sắc ký.

Khi yếu tố phân giải giảm và các pic trở nên gần nhau hơn, việc phân lập trở nên khó khăn.

Mặc dù không lý tưởng nhưng sự phân lập của các chất tinh khiết vẫn có thể thực hiện được với độ phân giải R = 0.6 nhưng việc này đòi hỏi một điểm cắt trong các phân đoạn thu được. Chỉ các phân đoạn rìa tùy theo mỗi pic được thu thập và phần còn lại nằm giữa chúng có thể được thu hồi và tái phân lập.

Trường hợp tiến hành sắc ký quá tải có thể xảy ra hiện tượng kéo đuôi, cần có sự điều chỉnh vị trí thu thập để tránh lẫn phần kéo đuôi của pic trước.

2.9. Sắc ký cột nhanh (FC – Flash Chromatography). 2.9.1. Nguyên tắc. 2.9.1. Nguyên tắc.

Sự phân lập sắc ký dựa trên một trạng thái cân bằng giữa các thành phần cần phân lập, một tác nhân hấp phụ trong cột (pha tĩnh) và một dung môi chảy xuyên qua nó (pha động).

Khi một thành phần phân tán vào pha tĩnh được định nghĩa là sự hấp phụ, sự tách ra bởi pha động được định nghĩa là sự phản hấp phụ. Khả năng hấp phụ cao giữa các thành phần và pha tĩnh đồng nghĩa với sự lưu giữ của các chất này, được xem như chậm trong sự rửa giải cột. Sự phân lập của một hỗn hợp ra các thành phần riêng biệt chỉ có thể thực hiện khi mỗi thành phần này có đặc tính hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau.

2.9.2. Lựa chọn pha tĩnh phù hợp.

Có thể tiến hành sắc ký trên cả pha tĩnh phân cực và không phân cực, độ hấp phụ tùy thuộc vào mỗi nhà sản xuất.

Sắc ký chuẩn yêu cầu sử dụng pha tĩnh phân cực như silica gel và dung môi không phân cực. Các thành phần riêng lẻ bị lưu giữ là do tương tác giữa nhóm chức phân cực của nó với chất hấp phụ. Các chất phân cực yếu được rửa giải ra trước, tiếp sau đó là các chất phân cực mạnh hơn.

Trong sắc ký pha đảo, pha tĩnh là chất không phân cực và sự rửa giải được thực hiện bởi dung môi phân cực. Những pha tĩnh này được thiết kế bằng cách thay đổi silica

gel với nhóm không phân cực nhưng C-18 hoặc những gốc tương đồng. Vật liệu pha đảo mắc hơn nhiều so với pha tĩnh chuẩn và đó là lý do chính khiến pha tĩnh chuẩn được sử dụng chủ yếu trong sắc ký nhanh.

2.9.3. Khảo sát hệ thống sắc ký trƣớc bằng sắc ký lớp mỏng.

Như đã đề cập, đa phần sắc ký cột nhanh sử dụng pha tĩnh là silica gel bình thường hoặc phân cực cao do đó việc tiến hành khảo sát trước bằng TLC là hợp lý với một sự đầu tư nhỏ nhất về thời gian và vật liệu, hứa hẹn tìm ra điều kiện sắc ký có khả năng áp dụng cho cột sắc ký nhanh.

Xác định pha tĩnh

Tìm pha động với sự chọn lọc nhất Xác định độ mạnh dung môi

Một cách lý tưởng, chất hấp phụ trên 2 loại sắc ký nên giống nhau để khả năng áp dụng từ TLC cho FC là cao nhất.

Khảo sát pha tĩnh

Thực nghiệm với TLC có thể giúp đưa ra chọn lựa đúng đắn. Nếu TLC với silica gel thường được sử dụng cho kết quả tốt thì cũng có thể sử dụng cho FC. Nếu kết quả không đạt, khi đó mới nghĩ đến khả năng sử dụng pha đảo.

Khảo sát dung môi

Một khi đã chọn được pha tĩnh với những đặc tính thích hợp, dung môi hoặc hỗn hợp dung môi phân lập các chất thành phần sẽ được khảo sát.

Một cách tổng quát, mỗi dung môi đều có những đặc tính riêng, một số có xu hướng giống nhau trong khi một số thì khác nhau rất nhiều. L.R.Snyder và J.J.Kirkland đã nghiên cứu và so sánh các kết quả đặc tính của nhiều loại dung môi và các nhóm dung

Nhóm chọn lọc cho phép công việc tìm kiếm được tập trung, sẽ có ít điểm so sánh khi mà dung môi chung nhóm. Công việc sẽ được tiến hành theo hướng so sánh giữa các nhóm đặc tính. Những dung môi quan trọng cho sắc ký được trình bày theo bảng sau chỉ bao gồm các dung môi có thể dùng trong phân lập sử dụng bộ phận phát hiện UV (không gây tín hiệu)

Dựa trên độ phân cực của các thành phần cần được phân lập, trong trường hợp độ dung môi có độ mạnh quá lớn khiến không thể phân tách được, độ mạnh của dung môi có thể được giảm xuống bằng cách hòa tan thêm hexane (độ mạnh 0.1), ngay lập tức có thể phân lập tốt.

Giảm độ mạnh của dung môi (trái: dichloromethane, phải: Hexane:dichloromethane 3:1).

Việc thêm hexane giúp giảm độ mạnh của dung môi nhưng không tác động lên tính chọn lọc (khả năng phân giải).

Tùy theo thành phần được lựa chọn để chọn dung môi có sự chọn lọc thích hợp. Bản VI có sự phân tách tốt nhưng nếu chỉ quan tâm tới việc phân lập thành phần đầu tiên, dung môi chạy ở bản V sẽ được chọn.

Lý tưởng = các thành phần khác càng tách xa chất cần tách càng tốt.

2.9.4. Từ TLC đến FC.

Do hiệu năng tách của TLC cao hơn so với FC nên cần phải có sự điều chỉnh khi áp dụng từ TLC đến FC

Thể tích cột CV = 1/Rf

Rf nằmtrong khoảng từ 0.15 – 0.4 sẽ tương ứng với thể tích cột 2.5 -6.6

2.9.5. Nạp mẫu lên cột.

Lúc trước, quy định chung cho sắc ký chế hóa là cột có thể nập mẫu ở nồng độ gần 1% tùy theo loại silica gel, ngày nay với việc sử dụng FC và tối ưu hóa pha động (Rf 0.04 – 0.4, CV > 1), nồng độ mẫu nạp có thể tăng đến 10% và sự phân lập nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều. Khi đó thể tích mẫu sẽ nhỏ và được nạp thành băng có độ hẹp tối thiểu, hiệu năng tách sẽ cao.

2.9.6. Rửa giải theo gradient.

Khảo sát pha động và ghi nhận sự phân tách các peak theo mỗi pha.

Chia phân đoạn để thay đổi dung môi nhằm tách tốt hơn.

PHẦN 3

HPLC ĐIỀU CHẾ 3.1. Nguyên tắc - yêu cầu.

Sự tách cá c chất bằng phương pháp sắc ký dựa trên trạng thái cân bằng giữa các thành phần, một chất hấp phu ̣ trong cột (=pha tĩnh) và một dung môi chảy qua nó (pha đô ̣ng). Khi một thành phần liên kết với pha tĩnh , hiê ̣n tượng này được định nghĩa là sự hấp phụ, khi thành phần này bi ̣ tách ra nhờ pha đô ̣ng , hiê ̣n tượng này được định nghĩa là phản hấp phụ. Khả năng hấp phụ cao giữa các thành phần nghiên cứu với pha tĩnh nghĩa là sự lưu giữ các thành phần này trên cô ̣t cao và do đó thành phần đó sẽ được rửa giải ra khỏi cột trễ hơn thành phần khác . Việc tách riêng các chất từ mô ̣t hỗn hợp thành chỉ có thể tiến hành mỗi chất có khả năng hấp phu ̣ và phản hấp phu ̣ khác nhau đối với pha tĩnh và pha động.

Sơ đồ mô hình sắc ký lỏng chế hóa

Bình chứa dung môi Bơm dung môi

Bình chứa mẫu Bơm mẫu

Valve bơm

mẫu

Cột sắc ký chế hóa

Detector

Bộ xử lý dữ liệu

Valve bơm

HPLC điều chế là mô ̣t phương pháp hiê ̣u quả và đang được sử du ̣ng rất phổ biến để tách các chất cần nghiên cứu ra khỏi 1 hỗn hơ ̣p hoă ̣c để tinh chế các chất.

Các yếu tố sau đây phải đƣợc chú ý đặc biệt:

- Linh hoạt trong việc chọn cột . Số lượng chất và các yêu cầu tách ảnh hưởng khác nhau đến các vấn đề cần giải quyết. Đơn giản và phù hợp với kinh tế của mô ̣t vấn đề phân tích cụ thể do đó có thể giải quyết được.

- Hiệu suất bơm cao hơn. Dung tích cô ̣t lớn yêu cầu thể tích dòng lớn hơn , do đó tốc đô ̣ dòng cũng cần phải lớn hơn.

- Áp suất lớn hơn . Khuynh hướ ng của sắc ký điều chế rõ ràng là hướng về chất hấp phụ dạng hạt mịn, điều này dẫn đến một kháng lực dòng đáng chú ý

3.2. Ƣu- nhƣợc điểm, khả năng và mức độ ứng dụng.

Kích thước tiểu phân càng nhỏ hiệu quả quá trình tách chiết càng cao. Tuy nhiên kích thước tiểu phân càng nhỏ thì áp suất phản hồi trong cột nhồi càng cao, điều đó giới hạn kích thước thực tế tiểu phân, tùy thuộc vào khả năng chịu áp của thiết bị. Nói chung, đa số thiết bị chịu được áp suất phản hồi gây ra bởi tiểu phân kích thước 5µm ở tốc độ dòng tối ưu.

Giá thành cao.

Trong phân tách điều chế, pha tĩnh thường có thể hồi phục và tái sử dụng để tinh chế cùng hoạt chất. Dung môi chạy sắc kí mới là phần tốn kém và khả năng tái sử dụng dung môi đã dùng là quan trọng trong lựa chọn dung môi. Nếu trong quá trình chạy ta dùng nhiều dung môi, ví dụ 1 dung môi để tiêm mẫu và 1 dung môi khác để rửa giải, thì nên gom riêng các dung môi để tiện cho việc tái chế. 1 vài hỗn hợp dung môi hexane– methyl-tert-butyl ether, hexane–ether, và hỗn hợp 3 thành phần không thể phục hồi như dung môi tinh khiết.

Trong kỹ thuâ ̣t HPLC điều chế, cần sử du ̣ng cô ̣t có kích thước lớn. Nếu bán kính cô ̣t tăng, trừ phi sử du ̣ng kỹ thuâ ̣t nhồi đă ̣c biê ̣t , sự nhồi ha ̣t trong cô ̣t sẽ trở nên không hiê ̣u

Ngươ ̣c la ̣i, nếu tăng chiều dài cô ̣t, thì kháng lực dòng chảy sẽ lớn hơn dẫn đến áp suất cao trong cô ̣t. Nếu sử du ̣ng cô ̣t có bán kính lớn, sau đó nhờ sức ma ̣nh cơ khí của hê ̣ thống cô ̣t sẽ hạn chế áp suất tối đa trong cột . Do đó, khi kéo dài cô ̣t sắc ký thì bán kính ha ̣t nhồi phải tăng lên để cung cấp đủ tính thấm . Tăng đường kính ha ̣t sẽ làm giảm hiê ̣u quả của cô ̣t, do đó sẽ làm giảm đô ̣ phân giải của các chất cần nghiên cứu . Thâ ̣t vâ ̣y, viê ̣c tính toán cho mô ̣t kỹ thuâ ̣t sắc ký điều chế rất phức ta ̣p , phải kiểm soát nhiều yếu tố tương tác , và vì vậy, các thông số tối ưu cần cho việc phân tách rất khó xác định . Để hiểu đươ ̣c các yếu tố cần thiết của sắc ký điều chế cần phải xác đi ̣nh công suất tải của cô ̣t .

3.3. Pha tĩnh, cách chuẩn bị cột.

Lí thuyết của van Deemter cho rằng tính chất quan trọng nhất của pha tĩnh là sự dễ dàng của sự chuyển khối qua các lỗ của tiểu phân.

Các tiểu phân silica thì dễ đạt độ đồng đều về kích thước lỗ và độ đồng nhất của các tiểu phân hơn các tiểu phân polymer. Điều này không có nghĩa là polymerics kém hơn, ngược lại những pha tĩnh này có kích cỡ tiểu phân đồng đều hơn. Bởi vì sự khác biệt giữa pha tĩnh silica và polymer ít rõ ràng khi so sánh chúng ở dạng cột nhồi sẵn (được nhồi ở áp suất cao hơn cột DAC dẫn tới sự biến dạng của các tiểu phân polymer- điều này làm giảm các khe hỡ  tạo các tiểu phân nhỏ hơn)

IUPAC định nghĩa pha thuận như là 1 tiến trình rửa giải trong đó pha tĩnh thì phân cực hơn pha động. trong thực tế, pha tĩnh thường dùng cho HPLC điều chế dựa trên silica và tính phân cực của silyl ether ở dưới và silanol cung cấp bề mặt thân nước. Liên kết amino và cyano với silica cũng phổ biến trong pha thuận mặc dù liên kết với cyano có vài tính chất của pha đảo. Cơ chế chiếm ưu thế là liên kết Hydro. Tuy nhiên nhóm silanol có tính acid nhẹ, vì thế bề mặt silica cũng có khả năng trao đổi cation.

Pha thuận thường dùng để tinh chế những phân tử hữu cơ nhỏ, vì thế kĩ thuật này thường dùng trong dược phẩm và nông dược.Sự phát triển từ sắc kí cột nhanh tới HPLC điều chế dễ dàng hiểu được đối với những nhà hóa học hữu cơ truyền thống và nó dẫn tới sự chấp nhận kĩ thuật này với nhiều ng tiên phong và sự tách chiết chất từ thực vật. 1 sự chuyển tiếp đồng thời từ những tiểu phân vô định hình irregular tới những tiểu phân pha

tĩnh có dạng hình cầu chắc chắn (điều chế bằng cách phun dung dịch silicate trung tính thành những giọt nhỏ trong 1 luồng khí nóng, hay phân tán dung dịch silica thành dạng nhũ tương trong 1 dung môi hữu cơ thích hợp, tại đó những giọt gel hình cầu hình thành. Tuy nhiên chi tiết việc sản xuất được giấu kín LC-A3) cũng được thúc đẩy bởi nhu cầu tăng dần. Như đã nói trước, tiểu phân silica vô định hình thường dễ bị đứt gãy và tạo thành bụi mịn.

Pha tĩnh bao phủ bởi các nhóm –OH thiết kế cho sắc kí loại cỡ như Zorbax GF 250 và PL-aquagel cũng tương tự pha thuận, thuận lợi của chúng ở chỗ tăng độ ổn định ở pH cao. Lựa chọn pha tĩnh trong qua trình nâng cấp qui mô (từ sắc kí phân tích) 1 tiêu chuẩn quan trọng khi phát triển phương pháp ban đầu là pha tĩnh sắc kí dùng trong qui trình nâng cấp phải có bán sẵn ở cả dạng cột phân tích (250mm x 4mm) và dạng thô ở lượng lớn. Nói chung, vật liệu nhồi thường dùng cho cột điều chế có kích cỡ từ 10-20 cm.

3.3.1. Normal-phase silica gels.

• Kromasil, 10 µm dp with 60 or 100 Å pore diameter • Kromasil, 16 µm dp with 100 Å pore diameter

• Chiralcel AS, 20 µm dp • Chiralcel OD, 20 µm dp

3.3.2. Reversed-phase silica gels.

• Kromasil C8 • YMC C18 • Hyperprep C8

Mặc dù hầu như 84% pha tĩnh dung trong HPLC điều chế là silica pha đảo. Tuy vậy, pha thuận có những lợi điểm riêng:

+ Có thể chuyển đổi trực tiếp từ TLC pha thuận hoặc HPLC sang LC chế hóa.

+ Loại bỏ dung môi thường dùng trong sắc kí pha thuận khỏi dịch sản phẩm cuồi dễ dàng hơn loại bỏ nước khỏi 1 phân đoạn của sắc kí pha đảo, có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp và