2.9.1. Nguyên tắc.
Sự phân lập sắc ký dựa trên một trạng thái cân bằng giữa các thành phần cần phân lập, một tác nhân hấp phụ trong cột (pha tĩnh) và một dung môi chảy xuyên qua nó (pha động).
Khi một thành phần phân tán vào pha tĩnh được định nghĩa là sự hấp phụ, sự tách ra bởi pha động được định nghĩa là sự phản hấp phụ. Khả năng hấp phụ cao giữa các thành phần và pha tĩnh đồng nghĩa với sự lưu giữ của các chất này, được xem như chậm trong sự rửa giải cột. Sự phân lập của một hỗn hợp ra các thành phần riêng biệt chỉ có thể thực hiện khi mỗi thành phần này có đặc tính hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau.
2.9.2. Lựa chọn pha tĩnh phù hợp.
Có thể tiến hành sắc ký trên cả pha tĩnh phân cực và không phân cực, độ hấp phụ tùy thuộc vào mỗi nhà sản xuất.
Sắc ký chuẩn yêu cầu sử dụng pha tĩnh phân cực như silica gel và dung môi không phân cực. Các thành phần riêng lẻ bị lưu giữ là do tương tác giữa nhóm chức phân cực của nó với chất hấp phụ. Các chất phân cực yếu được rửa giải ra trước, tiếp sau đó là các chất phân cực mạnh hơn.
Trong sắc ký pha đảo, pha tĩnh là chất không phân cực và sự rửa giải được thực hiện bởi dung môi phân cực. Những pha tĩnh này được thiết kế bằng cách thay đổi silica
gel với nhóm không phân cực nhưng C-18 hoặc những gốc tương đồng. Vật liệu pha đảo mắc hơn nhiều so với pha tĩnh chuẩn và đó là lý do chính khiến pha tĩnh chuẩn được sử dụng chủ yếu trong sắc ký nhanh.
2.9.3. Khảo sát hệ thống sắc ký trƣớc bằng sắc ký lớp mỏng.
Như đã đề cập, đa phần sắc ký cột nhanh sử dụng pha tĩnh là silica gel bình thường hoặc phân cực cao do đó việc tiến hành khảo sát trước bằng TLC là hợp lý với một sự đầu tư nhỏ nhất về thời gian và vật liệu, hứa hẹn tìm ra điều kiện sắc ký có khả năng áp dụng cho cột sắc ký nhanh.
Xác định pha tĩnh
Tìm pha động với sự chọn lọc nhất Xác định độ mạnh dung môi
Một cách lý tưởng, chất hấp phụ trên 2 loại sắc ký nên giống nhau để khả năng áp dụng từ TLC cho FC là cao nhất.
Khảo sát pha tĩnh
Thực nghiệm với TLC có thể giúp đưa ra chọn lựa đúng đắn. Nếu TLC với silica gel thường được sử dụng cho kết quả tốt thì cũng có thể sử dụng cho FC. Nếu kết quả không đạt, khi đó mới nghĩ đến khả năng sử dụng pha đảo.
Khảo sát dung môi
Một khi đã chọn được pha tĩnh với những đặc tính thích hợp, dung môi hoặc hỗn hợp dung môi phân lập các chất thành phần sẽ được khảo sát.
Một cách tổng quát, mỗi dung môi đều có những đặc tính riêng, một số có xu hướng giống nhau trong khi một số thì khác nhau rất nhiều. L.R.Snyder và J.J.Kirkland đã nghiên cứu và so sánh các kết quả đặc tính của nhiều loại dung môi và các nhóm dung
Nhóm chọn lọc cho phép công việc tìm kiếm được tập trung, sẽ có ít điểm so sánh khi mà dung môi chung nhóm. Công việc sẽ được tiến hành theo hướng so sánh giữa các nhóm đặc tính. Những dung môi quan trọng cho sắc ký được trình bày theo bảng sau chỉ bao gồm các dung môi có thể dùng trong phân lập sử dụng bộ phận phát hiện UV (không gây tín hiệu)
Dựa trên độ phân cực của các thành phần cần được phân lập, trong trường hợp độ dung môi có độ mạnh quá lớn khiến không thể phân tách được, độ mạnh của dung môi có thể được giảm xuống bằng cách hòa tan thêm hexane (độ mạnh 0.1), ngay lập tức có thể phân lập tốt.
Giảm độ mạnh của dung môi (trái: dichloromethane, phải: Hexane:dichloromethane 3:1).
Việc thêm hexane giúp giảm độ mạnh của dung môi nhưng không tác động lên tính chọn lọc (khả năng phân giải).
Tùy theo thành phần được lựa chọn để chọn dung môi có sự chọn lọc thích hợp. Bản VI có sự phân tách tốt nhưng nếu chỉ quan tâm tới việc phân lập thành phần đầu tiên, dung môi chạy ở bản V sẽ được chọn.
Lý tưởng = các thành phần khác càng tách xa chất cần tách càng tốt.
2.9.4. Từ TLC đến FC.
Do hiệu năng tách của TLC cao hơn so với FC nên cần phải có sự điều chỉnh khi áp dụng từ TLC đến FC
Thể tích cột CV = 1/Rf
Rf nằmtrong khoảng từ 0.15 – 0.4 sẽ tương ứng với thể tích cột 2.5 -6.6
2.9.5. Nạp mẫu lên cột.
Lúc trước, quy định chung cho sắc ký chế hóa là cột có thể nập mẫu ở nồng độ gần 1% tùy theo loại silica gel, ngày nay với việc sử dụng FC và tối ưu hóa pha động (Rf 0.04 – 0.4, CV > 1), nồng độ mẫu nạp có thể tăng đến 10% và sự phân lập nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều. Khi đó thể tích mẫu sẽ nhỏ và được nạp thành băng có độ hẹp tối thiểu, hiệu năng tách sẽ cao.
2.9.6. Rửa giải theo gradient.
Khảo sát pha động và ghi nhận sự phân tách các peak theo mỗi pha.
Chia phân đoạn để thay đổi dung môi nhằm tách tốt hơn.
PHẦN 3
HPLC ĐIỀU CHẾ 3.1. Nguyên tắc - yêu cầu.
Sự tách cá c chất bằng phương pháp sắc ký dựa trên trạng thái cân bằng giữa các thành phần, một chất hấp phu ̣ trong cột (=pha tĩnh) và một dung môi chảy qua nó (pha đô ̣ng). Khi một thành phần liên kết với pha tĩnh , hiê ̣n tượng này được định nghĩa là sự hấp phụ, khi thành phần này bi ̣ tách ra nhờ pha đô ̣ng , hiê ̣n tượng này được định nghĩa là phản hấp phụ. Khả năng hấp phụ cao giữa các thành phần nghiên cứu với pha tĩnh nghĩa là sự lưu giữ các thành phần này trên cô ̣t cao và do đó thành phần đó sẽ được rửa giải ra khỏi cột trễ hơn thành phần khác . Việc tách riêng các chất từ mô ̣t hỗn hợp thành chỉ có thể tiến hành mỗi chất có khả năng hấp phu ̣ và phản hấp phu ̣ khác nhau đối với pha tĩnh và pha động.
Sơ đồ mô hình sắc ký lỏng chế hóa
Bình chứa dung môi Bơm dung môi
Bình chứa mẫu Bơm mẫu
Valve bơm
mẫu
Cột sắc ký chế hóa
Detector
Bộ xử lý dữ liệu
Valve bơm
HPLC điều chế là mô ̣t phương pháp hiê ̣u quả và đang được sử du ̣ng rất phổ biến để tách các chất cần nghiên cứu ra khỏi 1 hỗn hơ ̣p hoă ̣c để tinh chế các chất.
Các yếu tố sau đây phải đƣợc chú ý đặc biệt:
- Linh hoạt trong việc chọn cột . Số lượng chất và các yêu cầu tách ảnh hưởng khác nhau đến các vấn đề cần giải quyết. Đơn giản và phù hợp với kinh tế của mô ̣t vấn đề phân tích cụ thể do đó có thể giải quyết được.
- Hiệu suất bơm cao hơn. Dung tích cô ̣t lớn yêu cầu thể tích dòng lớn hơn , do đó tốc đô ̣ dòng cũng cần phải lớn hơn.
- Áp suất lớn hơn . Khuynh hướ ng của sắc ký điều chế rõ ràng là hướng về chất hấp phụ dạng hạt mịn, điều này dẫn đến một kháng lực dòng đáng chú ý
3.2. Ƣu- nhƣợc điểm, khả năng và mức độ ứng dụng.
Kích thước tiểu phân càng nhỏ hiệu quả quá trình tách chiết càng cao. Tuy nhiên kích thước tiểu phân càng nhỏ thì áp suất phản hồi trong cột nhồi càng cao, điều đó giới hạn kích thước thực tế tiểu phân, tùy thuộc vào khả năng chịu áp của thiết bị. Nói chung, đa số thiết bị chịu được áp suất phản hồi gây ra bởi tiểu phân kích thước 5µm ở tốc độ dòng tối ưu.
Giá thành cao.
Trong phân tách điều chế, pha tĩnh thường có thể hồi phục và tái sử dụng để tinh chế cùng hoạt chất. Dung môi chạy sắc kí mới là phần tốn kém và khả năng tái sử dụng dung môi đã dùng là quan trọng trong lựa chọn dung môi. Nếu trong quá trình chạy ta dùng nhiều dung môi, ví dụ 1 dung môi để tiêm mẫu và 1 dung môi khác để rửa giải, thì nên gom riêng các dung môi để tiện cho việc tái chế. 1 vài hỗn hợp dung môi hexane– methyl-tert-butyl ether, hexane–ether, và hỗn hợp 3 thành phần không thể phục hồi như dung môi tinh khiết.
Trong kỹ thuâ ̣t HPLC điều chế, cần sử du ̣ng cô ̣t có kích thước lớn. Nếu bán kính cô ̣t tăng, trừ phi sử du ̣ng kỹ thuâ ̣t nhồi đă ̣c biê ̣t , sự nhồi ha ̣t trong cô ̣t sẽ trở nên không hiê ̣u
Ngươ ̣c la ̣i, nếu tăng chiều dài cô ̣t, thì kháng lực dòng chảy sẽ lớn hơn dẫn đến áp suất cao trong cô ̣t. Nếu sử du ̣ng cô ̣t có bán kính lớn, sau đó nhờ sức ma ̣nh cơ khí của hê ̣ thống cô ̣t sẽ hạn chế áp suất tối đa trong cột . Do đó, khi kéo dài cô ̣t sắc ký thì bán kính ha ̣t nhồi phải tăng lên để cung cấp đủ tính thấm . Tăng đường kính ha ̣t sẽ làm giảm hiê ̣u quả của cô ̣t, do đó sẽ làm giảm đô ̣ phân giải của các chất cần nghiên cứu . Thâ ̣t vâ ̣y, viê ̣c tính toán cho mô ̣t kỹ thuâ ̣t sắc ký điều chế rất phức ta ̣p , phải kiểm soát nhiều yếu tố tương tác , và vì vậy, các thông số tối ưu cần cho việc phân tách rất khó xác định . Để hiểu đươ ̣c các yếu tố cần thiết của sắc ký điều chế cần phải xác đi ̣nh công suất tải của cô ̣t .
3.3. Pha tĩnh, cách chuẩn bị cột.
Lí thuyết của van Deemter cho rằng tính chất quan trọng nhất của pha tĩnh là sự dễ dàng của sự chuyển khối qua các lỗ của tiểu phân.
Các tiểu phân silica thì dễ đạt độ đồng đều về kích thước lỗ và độ đồng nhất của các tiểu phân hơn các tiểu phân polymer. Điều này không có nghĩa là polymerics kém hơn, ngược lại những pha tĩnh này có kích cỡ tiểu phân đồng đều hơn. Bởi vì sự khác biệt giữa pha tĩnh silica và polymer ít rõ ràng khi so sánh chúng ở dạng cột nhồi sẵn (được nhồi ở áp suất cao hơn cột DAC dẫn tới sự biến dạng của các tiểu phân polymer- điều này làm giảm các khe hỡ tạo các tiểu phân nhỏ hơn)
IUPAC định nghĩa pha thuận như là 1 tiến trình rửa giải trong đó pha tĩnh thì phân cực hơn pha động. trong thực tế, pha tĩnh thường dùng cho HPLC điều chế dựa trên silica và tính phân cực của silyl ether ở dưới và silanol cung cấp bề mặt thân nước. Liên kết amino và cyano với silica cũng phổ biến trong pha thuận mặc dù liên kết với cyano có vài tính chất của pha đảo. Cơ chế chiếm ưu thế là liên kết Hydro. Tuy nhiên nhóm silanol có tính acid nhẹ, vì thế bề mặt silica cũng có khả năng trao đổi cation.
Pha thuận thường dùng để tinh chế những phân tử hữu cơ nhỏ, vì thế kĩ thuật này thường dùng trong dược phẩm và nông dược.Sự phát triển từ sắc kí cột nhanh tới HPLC điều chế dễ dàng hiểu được đối với những nhà hóa học hữu cơ truyền thống và nó dẫn tới sự chấp nhận kĩ thuật này với nhiều ng tiên phong và sự tách chiết chất từ thực vật. 1 sự chuyển tiếp đồng thời từ những tiểu phân vô định hình irregular tới những tiểu phân pha
tĩnh có dạng hình cầu chắc chắn (điều chế bằng cách phun dung dịch silicate trung tính thành những giọt nhỏ trong 1 luồng khí nóng, hay phân tán dung dịch silica thành dạng nhũ tương trong 1 dung môi hữu cơ thích hợp, tại đó những giọt gel hình cầu hình thành. Tuy nhiên chi tiết việc sản xuất được giấu kín LC-A3) cũng được thúc đẩy bởi nhu cầu tăng dần. Như đã nói trước, tiểu phân silica vô định hình thường dễ bị đứt gãy và tạo thành bụi mịn.
Pha tĩnh bao phủ bởi các nhóm –OH thiết kế cho sắc kí loại cỡ như Zorbax GF 250 và PL-aquagel cũng tương tự pha thuận, thuận lợi của chúng ở chỗ tăng độ ổn định ở pH cao. Lựa chọn pha tĩnh trong qua trình nâng cấp qui mô (từ sắc kí phân tích) 1 tiêu chuẩn quan trọng khi phát triển phương pháp ban đầu là pha tĩnh sắc kí dùng trong qui trình nâng cấp phải có bán sẵn ở cả dạng cột phân tích (250mm x 4mm) và dạng thô ở lượng lớn. Nói chung, vật liệu nhồi thường dùng cho cột điều chế có kích cỡ từ 10-20 cm.
3.3.1. Normal-phase silica gels.
• Kromasil, 10 µm dp with 60 or 100 Å pore diameter • Kromasil, 16 µm dp with 100 Å pore diameter
• Chiralcel AS, 20 µm dp • Chiralcel OD, 20 µm dp
3.3.2. Reversed-phase silica gels.
• Kromasil C8 • YMC C18 • Hyperprep C8
Mặc dù hầu như 84% pha tĩnh dung trong HPLC điều chế là silica pha đảo. Tuy vậy, pha thuận có những lợi điểm riêng:
+ Có thể chuyển đổi trực tiếp từ TLC pha thuận hoặc HPLC sang LC chế hóa.
+ Loại bỏ dung môi thường dùng trong sắc kí pha thuận khỏi dịch sản phẩm cuồi dễ dàng hơn loại bỏ nước khỏi 1 phân đoạn của sắc kí pha đảo, có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp và cho chất lượng sản phẩm cao hơn và ít tốn năng lượng hơn.
3.4. Cách nhồi cột.
+ DAC (dynamic axial compression system- nén theo trục thẳng) phát minh bởi Couillard:
+ radial compression system- phát triển bởi Waters, và thương mại hóa bởi Biotage: Dùng cartridge bằng polymer dẻo nhồi với pha tĩnh. Cartridge được đặt trong 1 xy-lanh (cyclinder) và được áp cho 1 áp suất ngoài.
+ annular expansion:
Dùng 1 que có đầu hình nêm nén pha tĩnh trong cột (tạo ra cả sự nén trục và nén kiểu tỏa tròn-radial)
Cách nhồi cột phụ thuộc vào thiết kế của cột. Kiểu cột ngắn với phần cột mở rộng có thể tháo rời và đủ để chứa hỗn hợp chất nhồi; cột dài, đủ lớn để chứa hỗn hợp chất nhồi pha tĩnh.
3.4.1. Cột kiểu 4.3.
Tính tổng thể tích của cột cộng với ống chứa(reservoir) để xác định thể tích hỗn hợp nhồi A. Mật độ nhồi của pha tĩnh polymer thường là 0.3g/cm3, của pha tĩnh silica thường là 0.6g/cm3. Thêm lượng thích hợp pha tĩnh vào 1 bình đựng và pha loãng với dung môi đã chọn để được thể tích A. Khuấy trộn bằng tay hay máy, khi đạt được hỗn hợp đồng nhất, ngừng khuấy và để hỗn hợp qua đêm để loại khí trong pha tĩnh.
Lắp cột, phần ống chứa; gắn bơm hút chân không và đồ hứng dung môi vào đáy cột. Không hút chân không ở giai đoạn này. Phân tán lại hỗn hợp, sau đó đổ liên tục hỗn hợp vào cột. Cần đổ nhanh để tránh hỗn hợp lắng trở lại; sự ngừng 1 vài giây cũng có thể dẫn đến nứt cột làm giảm hiệu lực tách. Hút chân không, rút dung môi cho tới khi còn 1 lớp dung môi khoảng vài mm trên mặt cột. Tháo ống hút chân không và bít đáy cột (end fitting) lại. Tháo ống chứa và gắn nắp trên (column top end-fitting). Gắn 1 đường dẫn dung môi thải vào dưới cột (đáy cột vẫn được bịt kín). Nén cột cho tới khi áp suất nén tới áp suất cho bởi nhà sản xuất (60-100 bar). Cột lúc này đã sẵn sàng cho nạp dung môi.
3.4.2. Cột kiểu hình 4.4.
Chuẩn bị hỗn hợp nhồi cột như trên. Bịt đáy cột và nạp cột nhu trên. Sau đó gắn piston lên trên cột, bình chứa dung môi, nén, mở đáy cột cho dung môi đi ra.
3.4.3. Chuẩn bị mẫu- Đƣa mẫu lên cột.
Đưa mẫu vào : bước này khá phức tạp vì áp suất đầu vào rất cao.
Thời gian lưu của mẫu (retention time): Là khoảng thời gian từ lúc đưa mẫu vào đến khi đỉnh (peak) của hiển thị rõ nét. Khoảng thời gian này bị chi phối bởi các yếu tố :