Rửa giải theo gradient

Khảo sát pha động và ghi nhận sự phân tách các peak theo mỗi pha.

Chia phân đoạn để thay đổi dung môi nhằm tách tốt hơn.

PHẦN 3

HPLC ĐIỀU CHẾ 3.1. Nguyên tắc - yêu cầu.

Sự tách cá c chất bằng phương pháp sắc ký dựa trên trạng thái cân bằng giữa các thành phần, một chất hấp phu ̣ trong cột (=pha tĩnh) và một dung môi chảy qua nó (pha đô ̣ng). Khi một thành phần liên kết với pha tĩnh , hiê ̣n tượng này được định nghĩa là sự hấp phụ, khi thành phần này bi ̣ tách ra nhờ pha đô ̣ng , hiê ̣n tượng này được định nghĩa là phản hấp phụ. Khả năng hấp phụ cao giữa các thành phần nghiên cứu với pha tĩnh nghĩa là sự lưu giữ các thành phần này trên cô ̣t cao và do đó thành phần đó sẽ được rửa giải ra khỏi cột trễ hơn thành phần khác . Việc tách riêng các chất từ mô ̣t hỗn hợp thành chỉ có thể tiến hành mỗi chất có khả năng hấp phu ̣ và phản hấp phu ̣ khác nhau đối với pha tĩnh và pha động.

Sơ đồ mô hình sắc ký lỏng chế hóa

Bình chứa dung môi Bơm dung môi

Bình chứa mẫu Bơm mẫu

Valve bơm

mẫu

Cột sắc ký chế hóa

Detector

Bộ xử lý dữ liệu

Valve bơm

HPLC điều chế là mô ̣t phương pháp hiê ̣u quả và đang được sử du ̣ng rất phổ biến để tách các chất cần nghiên cứu ra khỏi 1 hỗn hơ ̣p hoă ̣c để tinh chế các chất.

Các yếu tố sau đây phải đƣợc chú ý đặc biệt:

- Linh hoạt trong việc chọn cột . Số lượng chất và các yêu cầu tách ảnh hưởng khác nhau đến các vấn đề cần giải quyết. Đơn giản và phù hợp với kinh tế của mô ̣t vấn đề phân tích cụ thể do đó có thể giải quyết được.

- Hiệu suất bơm cao hơn. Dung tích cô ̣t lớn yêu cầu thể tích dòng lớn hơn , do đó tốc đô ̣ dòng cũng cần phải lớn hơn.

- Áp suất lớn hơn . Khuynh hướ ng của sắc ký điều chế rõ ràng là hướng về chất hấp phụ dạng hạt mịn, điều này dẫn đến một kháng lực dòng đáng chú ý

3.2. Ƣu- nhƣợc điểm, khả năng và mức độ ứng dụng.

Kích thước tiểu phân càng nhỏ hiệu quả quá trình tách chiết càng cao. Tuy nhiên kích thước tiểu phân càng nhỏ thì áp suất phản hồi trong cột nhồi càng cao, điều đó giới hạn kích thước thực tế tiểu phân, tùy thuộc vào khả năng chịu áp của thiết bị. Nói chung, đa số thiết bị chịu được áp suất phản hồi gây ra bởi tiểu phân kích thước 5µm ở tốc độ dòng tối ưu.

Giá thành cao.

Trong phân tách điều chế, pha tĩnh thường có thể hồi phục và tái sử dụng để tinh chế cùng hoạt chất. Dung môi chạy sắc kí mới là phần tốn kém và khả năng tái sử dụng dung môi đã dùng là quan trọng trong lựa chọn dung môi. Nếu trong quá trình chạy ta dùng nhiều dung môi, ví dụ 1 dung môi để tiêm mẫu và 1 dung môi khác để rửa giải, thì nên gom riêng các dung môi để tiện cho việc tái chế. 1 vài hỗn hợp dung môi hexane– methyl-tert-butyl ether, hexane–ether, và hỗn hợp 3 thành phần không thể phục hồi như dung môi tinh khiết.

Trong kỹ thuâ ̣t HPLC điều chế, cần sử du ̣ng cô ̣t có kích thước lớn. Nếu bán kính cô ̣t tăng, trừ phi sử du ̣ng kỹ thuâ ̣t nhồi đă ̣c biê ̣t , sự nhồi ha ̣t trong cô ̣t sẽ trở nên không hiê ̣u

Ngươ ̣c la ̣i, nếu tăng chiều dài cô ̣t, thì kháng lực dòng chảy sẽ lớn hơn dẫn đến áp suất cao trong cô ̣t. Nếu sử du ̣ng cô ̣t có bán kính lớn, sau đó nhờ sức ma ̣nh cơ khí của hê ̣ thống cô ̣t sẽ hạn chế áp suất tối đa trong cột . Do đó, khi kéo dài cô ̣t sắc ký thì bán kính ha ̣t nhồi phải tăng lên để cung cấp đủ tính thấm . Tăng đường kính ha ̣t sẽ làm giảm hiê ̣u quả của cô ̣t, do đó sẽ làm giảm đô ̣ phân giải của các chất cần nghiên cứu . Thâ ̣t vâ ̣y, viê ̣c tính toán cho mô ̣t kỹ thuâ ̣t sắc ký điều chế rất phức ta ̣p , phải kiểm soát nhiều yếu tố tương tác , và vì vậy, các thông số tối ưu cần cho việc phân tách rất khó xác định . Để hiểu đươ ̣c các yếu tố cần thiết của sắc ký điều chế cần phải xác đi ̣nh công suất tải của cô ̣t .

3.3. Pha tĩnh, cách chuẩn bị cột.

Lí thuyết của van Deemter cho rằng tính chất quan trọng nhất của pha tĩnh là sự dễ dàng của sự chuyển khối qua các lỗ của tiểu phân.

Các tiểu phân silica thì dễ đạt độ đồng đều về kích thước lỗ và độ đồng nhất của các tiểu phân hơn các tiểu phân polymer. Điều này không có nghĩa là polymerics kém hơn, ngược lại những pha tĩnh này có kích cỡ tiểu phân đồng đều hơn. Bởi vì sự khác biệt giữa pha tĩnh silica và polymer ít rõ ràng khi so sánh chúng ở dạng cột nhồi sẵn (được nhồi ở áp suất cao hơn cột DAC dẫn tới sự biến dạng của các tiểu phân polymer- điều này làm giảm các khe hỡ  tạo các tiểu phân nhỏ hơn)

IUPAC định nghĩa pha thuận như là 1 tiến trình rửa giải trong đó pha tĩnh thì phân cực hơn pha động. trong thực tế, pha tĩnh thường dùng cho HPLC điều chế dựa trên silica và tính phân cực của silyl ether ở dưới và silanol cung cấp bề mặt thân nước. Liên kết amino và cyano với silica cũng phổ biến trong pha thuận mặc dù liên kết với cyano có vài tính chất của pha đảo. Cơ chế chiếm ưu thế là liên kết Hydro. Tuy nhiên nhóm silanol có tính acid nhẹ, vì thế bề mặt silica cũng có khả năng trao đổi cation.

Pha thuận thường dùng để tinh chế những phân tử hữu cơ nhỏ, vì thế kĩ thuật này thường dùng trong dược phẩm và nông dược.Sự phát triển từ sắc kí cột nhanh tới HPLC điều chế dễ dàng hiểu được đối với những nhà hóa học hữu cơ truyền thống và nó dẫn tới sự chấp nhận kĩ thuật này với nhiều ng tiên phong và sự tách chiết chất từ thực vật. 1 sự chuyển tiếp đồng thời từ những tiểu phân vô định hình irregular tới những tiểu phân pha

tĩnh có dạng hình cầu chắc chắn (điều chế bằng cách phun dung dịch silicate trung tính thành những giọt nhỏ trong 1 luồng khí nóng, hay phân tán dung dịch silica thành dạng nhũ tương trong 1 dung môi hữu cơ thích hợp, tại đó những giọt gel hình cầu hình thành. Tuy nhiên chi tiết việc sản xuất được giấu kín LC-A3) cũng được thúc đẩy bởi nhu cầu tăng dần. Như đã nói trước, tiểu phân silica vô định hình thường dễ bị đứt gãy và tạo thành bụi mịn.

Pha tĩnh bao phủ bởi các nhóm –OH thiết kế cho sắc kí loại cỡ như Zorbax GF 250 và PL-aquagel cũng tương tự pha thuận, thuận lợi của chúng ở chỗ tăng độ ổn định ở pH cao. Lựa chọn pha tĩnh trong qua trình nâng cấp qui mô (từ sắc kí phân tích) 1 tiêu chuẩn quan trọng khi phát triển phương pháp ban đầu là pha tĩnh sắc kí dùng trong qui trình nâng cấp phải có bán sẵn ở cả dạng cột phân tích (250mm x 4mm) và dạng thô ở lượng lớn. Nói chung, vật liệu nhồi thường dùng cho cột điều chế có kích cỡ từ 10-20 cm.

3.3.1. Normal-phase silica gels.

• Kromasil, 10 µm dp with 60 or 100 Å pore diameter • Kromasil, 16 µm dp with 100 Å pore diameter

• Chiralcel AS, 20 µm dp • Chiralcel OD, 20 µm dp

3.3.2. Reversed-phase silica gels.

• Kromasil C8 • YMC C18 • Hyperprep C8

Mặc dù hầu như 84% pha tĩnh dung trong HPLC điều chế là silica pha đảo. Tuy vậy, pha thuận có những lợi điểm riêng:

+ Có thể chuyển đổi trực tiếp từ TLC pha thuận hoặc HPLC sang LC chế hóa.

+ Loại bỏ dung môi thường dùng trong sắc kí pha thuận khỏi dịch sản phẩm cuồi dễ dàng hơn loại bỏ nước khỏi 1 phân đoạn của sắc kí pha đảo, có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp và cho chất lượng sản phẩm cao hơn và ít tốn năng lượng hơn.

3.4. Cách nhồi cột.

+ DAC (dynamic axial compression system- nén theo trục thẳng) phát minh bởi Couillard:

+ radial compression system- phát triển bởi Waters, và thương mại hóa bởi Biotage: Dùng cartridge bằng polymer dẻo nhồi với pha tĩnh. Cartridge được đặt trong 1 xy-lanh (cyclinder) và được áp cho 1 áp suất ngoài.

+ annular expansion:

Dùng 1 que có đầu hình nêm nén pha tĩnh trong cột (tạo ra cả sự nén trục và nén kiểu tỏa tròn-radial)

Cách nhồi cột phụ thuộc vào thiết kế của cột. Kiểu cột ngắn với phần cột mở rộng có thể tháo rời và đủ để chứa hỗn hợp chất nhồi; cột dài, đủ lớn để chứa hỗn hợp chất nhồi pha tĩnh.

3.4.1. Cột kiểu 4.3.

Tính tổng thể tích của cột cộng với ống chứa(reservoir) để xác định thể tích hỗn hợp nhồi A. Mật độ nhồi của pha tĩnh polymer thường là 0.3g/cm3, của pha tĩnh silica thường là 0.6g/cm3. Thêm lượng thích hợp pha tĩnh vào 1 bình đựng và pha loãng với dung môi đã chọn để được thể tích A. Khuấy trộn bằng tay hay máy, khi đạt được hỗn hợp đồng nhất, ngừng khuấy và để hỗn hợp qua đêm để loại khí trong pha tĩnh.

Lắp cột, phần ống chứa; gắn bơm hút chân không và đồ hứng dung môi vào đáy cột. Không hút chân không ở giai đoạn này. Phân tán lại hỗn hợp, sau đó đổ liên tục hỗn hợp vào cột. Cần đổ nhanh để tránh hỗn hợp lắng trở lại; sự ngừng 1 vài giây cũng có thể dẫn đến nứt cột làm giảm hiệu lực tách. Hút chân không, rút dung môi cho tới khi còn 1 lớp dung môi khoảng vài mm trên mặt cột. Tháo ống hút chân không và bít đáy cột (end fitting) lại. Tháo ống chứa và gắn nắp trên (column top end-fitting). Gắn 1 đường dẫn dung môi thải vào dưới cột (đáy cột vẫn được bịt kín). Nén cột cho tới khi áp suất nén tới áp suất cho bởi nhà sản xuất (60-100 bar). Cột lúc này đã sẵn sàng cho nạp dung môi.

3.4.2. Cột kiểu hình 4.4.

Chuẩn bị hỗn hợp nhồi cột như trên. Bịt đáy cột và nạp cột nhu trên. Sau đó gắn piston lên trên cột, bình chứa dung môi, nén, mở đáy cột cho dung môi đi ra.

3.4.3. Chuẩn bị mẫu- Đƣa mẫu lên cột.

Đưa mẫu vào : bước này khá phức tạp vì áp suất đầu vào rất cao.

Thời gian lưu của mẫu (retention time): Là khoảng thời gian từ lúc đưa mẫu vào đến khi đỉnh (peak) của hiển thị rõ nét. Khoảng thời gian này bị chi phối bởi các yếu tố : + Áp suất đầu vào.

+ Tính chất của pha tĩnh (hợp chất, kích thước hạt). + Thành phần dung môi.

overload trong sắc kí: khi lượng mẫu nạp quá lớn và điều đó làm giảm hiệu năng của cột, có 2 loại: nạp vượt quá thể tích (volume overload) và nạp vượt quá khối/ nồng độ (mass overload); có thể do mặc định hoặc có chủ ý trong sắc kí điều chế.

+ Volume overload dẫn tới mở rộng peak, nhưng sự mở rộng này đối xứng vì thế hình dạng peak ở trước và sau không bị méo/ biến dạng. Trong sắc kí chế hóa thể tích mẫu có thể tăng cho tới khi 2 peak của 2 chất được rửa giải gần nhau nhất chạm nhau, và thể tích mẫu lúc này là tối ưu. Trong sắc kí phân tích thì không chấp nhận chuyện này, không dùng bất cứ cách nạp mẫu overload nào, ngoại trừ trong những trường hợp khả dĩ có thể làm tăng khả năng phân tích chất dạng vết.

+ Mass overload thì chắc chắn làm cho peak bị biến dạng; mức nồng độ chất cần tách trong pha tĩnh sẽ ở trong vùng không tuyến tính của đường đẳng nhiệt hấp phụ. Nếu đường đẳng nhiệt hấp phụ lõm về phía trục biểu thị nồng độ trong pha động thì ở nồng độ cao của chất tan hệ số phân bố hiệu dụng sẽ thấp hơn. Vì vậy phần có nồng độ chất tan cao hơn sẽ di chuyển trong cột nhanh hơn phần có nồng độ thấp, và peak sẽ bị méo với phía trước nhọn và đuôi bị nghiêng/ thoải. Thời gian lưu nói chung sẽ giảm. Tuy nhiên nếu đường đẳng nhiệt lõm về phía trục biểu diễn nồng độ trong pha tĩnh thì ở nồng độ cao của chất tan, hệ số phân bố hiệu dụng sẽ lớn hơn. Và vì thế phần có nồng độ cao hơn sẽ di chuyển chậm hơn phần có nồng độ thấp trong cột, peak sẽ bị méo với phía trước nghiêng và đuôi nhọn; trong trường hợp này thời gian lưu nói chung sẽ giảm khi khối mẫu tăng.

3.4.4. Với pha đảo (Reverse Phase HPLC Basics for LC/MS).

Mẫu không nên hòa tan trong 1 dung môi hữu cơ nếu không nó có thể không gắn lên pha tĩnh được. Mẫu cũng không nên tan trong dung dịch chứa chất tẩy, một vài chất tẩy có thể gắn lên cột pha đảo và làm thay đổi tính chất cột không thuận nghịch. Hơn nữa chất tẩy được ion hóa ưu tiên khi bị tác động của dòng electron trong đầu dò khối phổ, làm giảm khả năng phát hiện hay ức chế sự ion hóa chất phân tích.

Không 1 nghiên cứu nào về sắc kí gọi là hoàn chỉnh nếu thiếu phần nghiên cứu về nhiệt độ. Nhiệt độ xung quanh ảnh hưởng thời gian lưu. Nhiệt độ chạy thường là 40°C. Để ổn định nhiệt độ cho cột, ta có thể dùng jacket (áo giữ nhiệt), buồng ổn nhiệt,..

Có thể dùng nhiệt độ để tác động tới quá trình chiết tách. Nói chung nhiệt độ cao hơn thì tốt hơn, peak sẽ nhọn hơn và rửa giải sớm hơn. Tuy vậy nhiệt độ cao làm giảm tuổi thọ cột và nhiều cột không chịu được nhiệt độ quá 60°C.

3.5. Lựa chọn dung môi- Thay đổi dung môi.

Pha thuận thường được chạy với dung môi hữu cơ, thường là hexane, heptane, cyclohexane hay halocarbon như DCM, Cloroform. Pha động rửa giải thường là 1 dung môi thân nước, như nước, ester. Acid hữu cơ thường thêm vào để giảm thiểu hiệu ứng trao đổi ion do những nhóm silanol.

Rửa giải đẳng dòng với hỗn hợp butanol, acid acetiic và nước là giao thức chuẩn cho sự tách giải các acid amin và 1 hỗn hợp methanol, cloroform, nước hữu dụng cho hợp chất hữu cơ nói chung. Peptide dễ dàng được tinh chế bằng rửa giải kiểu gradient trên silica pha thuận, tăng dần từ acetonitrile tới pha động có nước. Kĩ thuật này đặc biệt hiệu quả với những peptide rất phân cực khó phân lập trên sắc kí pha đảo.

Pha đảo hoạt động trong môi trường đệm thân nước, nơi hấp phụ kị nước giữa chất phân tích và pha tĩnh bị xáo trộn bới sự tăng dần nồng độ 1 dung môi hữu cơ có thể hỏa lẫn. Ứng dụng phổ biến của HPLC pha đảo là trong tinh chế peptides và protein, trong đó chất phân tích thường được giả hấp bởi sự rửa giải gradient. Đệm chạy thân nước phổ biến nhất thường là nước chứa hàm lượng thấp của axit trifluoroacetic (thường là 0,1% v / v) và các pha động rửa giải thường là acetonitrile- chất điều chỉnh độ phân cực- chứa axít trifluoroacetic.

Các trifluoroacetic axit phục vụ hai mục đích: trước hết, nó tạo một cặp ion mạnh với chất phân tích, như vậy chống lại việc trao đổi cation với bất kỳ nhóm silanol tự do nào trên giá mang silica; và thứ nhì, với vai trò các cặp ion, nó làm giảm sự thay đôi cấu

nhiều phân tử khác. Các đệm acid khác như phosphate, acetate and hydrochloride cũng thường được dùng. Ethanol, methanol, tetrahydrofuran, pro-pionitrile và propan-2-ol cũng thường được dùng với vai trò chất điều chỉnh độ phân cực, nhưng chúng không tốt bằng acetonitrile.

Silica pha đảo không ổn định trong môi trường kiềm do sự mất các gốc ankyl và sự hòa tan của silica khi hoạt động lâu ở pH cao. Với pha tĩnh polymer lỗ lớn ổn định ở pH