vào tối ưu hoá cụ thể trên máy.
2.2.2.Thẩm định phương pháp phân tích Azithromycin trong huyết tương
2.2.2.1.Tính chọn lọc (Selectivity)
Tính chọn lọc-đặc hiệu là khả năng phân biệt các chất trong mẫu thử khi tách và định lượng 2 thành phần trở lên trong một hỗn hợp chất. Trong thực nghiệm này, tính chọn lọc-đặc hiệu của phương pháp được xác định bằng cách so sánh sắc đồ của 3 mẫu trắng và 3 mẫu thêm chuẩn AZI.
Yêu cầu tại vị trí tương ứng thời điểm trùng với thời gian lưu của pic AZI, kết quả phân tích của mẫu trắng khơng được xuất hiện pic.
2.2.2.2.Khoảng nồng độ tuyến tính
Độ tuyến tính của phương pháp phân tích là sự tương quan giữa đáp ứng phân tích và nồng độ chất phân tích trong một khoảng nồng độ xác định. Nó được biểu thị bằng hệ số tương quan r.
Trường hợp định lượng AZI trong huyết tương bằng LC-MS, dựng nội chuẩn, đáp ứng phân tích là tỷ số giữa diện tích pic của chất phân tích và nội chuẩn.
Mẫu huyết tương trắng được thêm AZI chuẩn sao cho có nồng độ từ 1/10 đến 1/30 Cmax tới 2-3 lần Cmax (dự đoán). Thường làm từ 5-7 điểm nồng độ của chất phân tích. Mối tương quan giữa tín hiệu đáp ứng của pic (tỷ số diện tích pic) và nồng độ AZI được biểu diễn bằng phương trình và hệ số tương quan hồi quy. Yêu cầu đường chuẩn phải có hệ số tương quan lớn hơn 0,99 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có
nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, riêng điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20%.
2.2.2.3. Độ đúng
Độ đúng của phương pháp là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy so với giá trị thực. Độ đúng thường được biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm thu hồi khi thêm một lượng xác định chất phân tích.
2.2.2.4. Độ lặp lại của phương pháp
Độ lặp lại của phương pháp biểu thị bằng mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi q trình phân tích được lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất.
Xử lý huyết tương ở 3 mức nồng độ: thấp, trung bình và cao. Ở mỗi mức nồng độ tiến hành với 5 mẫu độc lập, khảo sát độ lặp lại của tỷ lệ diện tích pic của AZI/IS. Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào RSD%.
Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các mẫu trong cùng nồng độ biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD% phải nhỏ hơn 15%. Tại nồng độ giới hạn định lượng (LOQ) thì RSD khơng vượt quá 20%.
2.2.2.5. Giới hạn định lượng (Limit of quantification-LOQ)
Giới hạn định lượng là nồng độ thấp nhất của mẫu thử có thể định lượng được với tính đúng và tính chính xác có thể chấp nhận được. LOQ được chấp nhận với điều kiện:
+ Đáp ứng của chất phân tích bằng hoặc lớn hơn 10 lần đáp ứng của mẫu trắng.
+ Pic của chất cần phân tích phải thấy rõ, riêng biệt và giá trị đáp ứng lặp lại với độ chính xác 20%.
Giới hạn định lượng của AZI trong huyết tương được xác định trực tiếp bằng cách thêm AZI chuẩn có nồng độ thấp dần vào từng mẫu huyết tương trắng, mỗi nồng độ 3 mẫu. Tiến hành phân tích và xác định LOQ.
2.2.2.6. Hiệu suất chiết
Chuẩn bị tương tự như mẫu chuẩn. Mẫu phân tích gồm các mẫu kiểm chứng nồng độ thấp, trung bình và cao (LQC, MQC và HQC) theo quy trình đã xây dựng. Song song tiến hành định lượng với các mẫu chuẩn pha trong pha động, có nồng độ tương ứng. Xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh kết quả định lượng AZI của mẫu có qua chiết tách với mẫu chuẩn pha trong pha động (không qua chiết tách). Phương pháp chiết tách, xử lý là thích hợp khi hiệu suất chiết không quá 110% và không thấp hơn 30%; RSD của giá trị hiệu suất chiết tại các nồng độ lệch nhau không quá 15%.
2.2.2.7. Độ ổn định của hoạt chất
Độ ổn định của hoạt chất là khả năng của hoạt chất được bảo quản trong điều kiện xác định có thể giữ được những đặc tính vốn có trong những giới hạn nhất định.
Thêm AZI chuẩn vào huyết tương trắng ở nồng độ QC: thấp, trung bình, cao. Các mẫu huyết tương được bảo quản ở T0 = -400C. Sau những khoảng thời gian nhất định tiến hành phân tích và tính nồng độ hoạt chất để đánh giá độ ổn định của mẫu trong thời gian bảo quản. So sánh giá trị của các lần phân tích sau với giá trị của lần phân tích đầu tiên. Yêu cầu lượng hoạt chất thay đổi phải nhỏ hơn 5%.
Nếu mẫu AZI không ổn định khi bảo quản ở T0 = -400C thì nghiên cứu độ ổn định khi bảo quản ở T0 = -800C tương tự như trên.
2.2.3. Đánh giá tương đương sinh học
Phương pháp đánh giá TĐSH được lựa chọn trên cơ sở các quy định của FDA, EU, WHO.
2.2.3.1. Chọn người tình nguyện
Lựa chọn NTN thử thuốc theo các quy định về lứa tuổi, cân nặng, chiều cao. Không hút thuốc lá, không nghiện rượu, không nghiện ma tuý, không nhiễm HIV...Đạt yêu cầu với các chỉ tiêu xét nghiệm hoá sinh và huyết học.
Sau khi được tuyển chọn theo tiêu chuẩn, được đọc và nghe phổ biến, giải thích các thơng tin liên quan đến nghiên cứu, NTN phải tự nguyện cam kết tham gia nghiên cứu và ký tên vào Bản cam kết theo mẫu đã được Hội đồng đạo đức thông qua.
Trong số 17 người tình nguyện: 3 NTN tham gia nghiên cứu khảo sát ban đầu để xây dựng mơ hình thực nghiệm, 14 NTN tham gia vào nghiên cứu TĐSH. Kết quả kiểm tra sức khoẻ NTN được trình bày ở phụ lục 1.
2.2.3.2. Phương pháp thăm dò SKD in vivo
- Tiến hành thăm dị SKD in vivo trên 3 người tình nguyện nam giới khoẻ mạnh, đó được kiểm tra các chỉ tiêu sinh hố và huyết học trước khi thử.
- Cho NTN uống 2 viên chế phẩm thử với 240mL nước ấm. NTN khơng được ăn trong vịng 10 giờ trước khi uống thuốc và ít nhất 4 giờ sau khi uống thuốc; khơng được nằm ít nhất 2 giờ sau khi uống thuốc.
- Lấy máu trực tiếp từ tĩnh mạch qua kim luồn đặt ở cánh tay NTN. Lấy 01 mẫu trong vòng 1 giờ trước khi uống thuốc và lấy tiếp vào các thời điểm sau khi uống 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 6; 8; 12; 24; 48; 72; 96 giờ. Lấy 3mL máu vào các ống nghiệm có chứa sẵn chất chống đơng EDTA, đậy nắp và lắc nhẹ ngay sau khi lấy, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. Tách lớp huyết tương vào ống nghiệm bảo quản ở tủ lạnh sâu -800C cho đến khi phân tích.
- NTN được theo dõi huyết áp và nhịp tim trước khi uống thuốc và khi kết thúc giai đoạn lấy mẫu.
2.2.3.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá TĐSH
- Sử dụng phương pháp mù đôi, chéo 2 giai đoạn, đơn liều. Phân ngẫu nhiên (gắp thăm) người tình nguyện vào nhóm thử.
- 14 NTN được phân ngẫu nhiên thành 2 nhóm, mỗi nhóm 7 người. - Thử nghiệm được tiến hành 2 giai đoạn, mỗi người tình nguyện trong
mỗi giai đoạn uống 2 viên chế phẩm thử (T) hoặc chế phẩm đối chiếu (R) tại 1 thời điểm (7giờ sáng). Thử nghiệm kéo dài 4 ngày và 4 đêm.
- Thời gian nghỉ giữa 2 giai đoạn: 14 ngày.
2.2.3.4. Uống thuốc
Bảng 2.1. Bố trí NTN uống thuốc
Thuốc Giai đoạn 1 Giai đoạn 2
Mã Mã
T 1 4 6 7 9 11 13 2 3 5 8 10 12 14
R 2 3 5 8 10 12 14 1 4 6 7 9 11 13
T: chế phẩm thử Azithromycin 250mg R: chế phẩm đối chiếu.
Mỗi NTN được uống 2 viên/1 lần trong 1 giai đoạn. Thuốc được uống với 240mL nước.
2.2.3.5. Lấy mẫu
Dựa vào các số liệu đó cơng bố của các tác giả về Tmax, T1/2 của AZI, kết hợp với kết quả điều tra sơ bộ của chúng tơi trên NTN, chương trình lấy mẫu được lựa chọn như sau:
- Trước khi uống thuốc: lấy một mẫu trắng để kiểm tra tính chọn lọc và kiểm định phương pháp.
- Sau khi uống thuốc: lấy mẫu máu tại các thời điểm 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 6; 8; 12; 24; 48; 72; 96 giờ. Tổng cộng: lấy 16 mẫu.
Tại mỗi thời điểm lấy mẫu, 3mL máu của NTN được lấy từ tĩnh mạch trước cánh tay qua ống luồn mềm đặt cố định, cho vào ống nghiệm chứa chất chống đông EDTA, lắc nhẹ. Máu được ly tâm lạnh 4000 vòng/phút trong thời gian 5 phút, tách lấy phần huyết tương, chuyển vào ống nghiệm nhựa, nút xoáy và được bảo quản ở nhiệt độ - 80oC tới khi phân tích.
Người tình nguyện được theo dõi nhịp tim, huyết áp 01 lần/giờ trong vòng 4 giờ sau khi uống thuốc. Việc theo dõi sức khoẻ người tình nguyện do các bác sỹ chuyên khoa nội Bệnh viện Đống Đa đảm nhiệm và được thực hiện theo yêu cầu của Hội đồng đạo đức.
2.2.4. Phân tích số liệu thực nghiệm
2.2.4.1. Xác định các thơng số DĐH
Dựa vào chương trình phần mềm WinNonlin 5.2 và chương trình phần mềm Excel để tính tốn, xử lý kết quả thực nghiệm và xây dựng đường cong dược động học.
- Sử dụng chương trình phần mềm Excel để tính các số liệu: Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn tương đối, khoảng tin cậy, phương trình hồi quy giữa đáp ứng phân tích và nồng độ AZI.
- Nồng độ AZI trong huyết tương được tính dựa vào phương trình hồi quy xây dựng từ mẫu trắng cho thêm AZI theo từng ngày phân tích.
- Tmax, Cmax xác định từ số liệu thực nghiệm.