hexan (1:1). - Pha động: MeCN-MeOH-đệm phosphat 0,04M (52: 9:39). - Tốc độ dịng: 1mL/phút. - Đường chuẩn: 40-800ng/mL Điện hố 8 [28] HT người Zorbax SBICN (150 x 4,6mm; 5µm).
- Dung môi chiết: Tert-butyl methyl ether. methyl ether. - Pha động: Na2HPO4 50mM - NaH2PO4 50mM -MeCN - MeOH; pH 6,5-7,5 - Tốc độ dịng: 1mL/phút. Điện hố
Nhận xét: Từ các tài liệu thu thập được, định lượng AZI trong huyết
tương có thể phát hiện bằng HPLC với detector huỳnh quang, điện hoá, khối phổ. Với detector huỳnh quang, AZI cần được dẫn chất hố, đáp ứng phân tích phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thời gian dẫn chất, môi trường phản ứng, nồng độ thuốc thử, do đó kết quả thu được khơng ổn định. Detector điện hố và khối phổ có thể phát hiện trực tiếp AZI, nhưng giới hạn định lượng khi dựng detector điện hố khơng đáp ứng u cầu nghiên cứu TĐSH (LOQ= 90ng/mL). Detector khối phổ định lượng nhanh, nhạy, tính chọn lọc cao, giới hạn định lượng thấp, rất phù hợp xác định các chất trong mẫu thử có nền mẫu phức tạp, đặc biệt là dịch sinh học. Do đó chúng tơi sẽ sử dụng phương pháp
LC-MS trong nghiên cứu này.
1.2.4.2. Các phương pháp khác ngoài sử dụng sắc ký
- Phương pháp Cực phổ, mẫu thử là dịch sinh học [39].
- Phương pháp Vi sinh [17]: Pha loãng HT bằng ethanol (1:1), ủ ở 4oC, ly tâm 12000 vòng/phút, lấy dịch nổi trên cơ ở 55oC đến thể tích ban đầu của mẫu. Định lượng trong môi trường thạch với chủng vi khuẩn chỉ thị là Micrococcus
luteus NCTC 8440, khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,005 đến 1mg/L.
1.3. PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS) [7]
LC-MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phân tích khối phổ. Sự kết hợp này tạo nên một hệ thống có những ứng dụng rộng lớn trong phân tích.
1.3.1. Ngun tắc
Khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử hoặc bằng dalton.
Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau, tập hợp thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối, cung cấp thơng tin để định tính, xác định cấu trúc và định lượng các chất.
1.3.2 Máy khối phổ
1.3.2.1. Bộ nạp mẫu (Inlet)
Đưa mẫu vào máy. Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn phải chuyển mẫu sang dạng hơi bằng cách thích hợp. Có thể nạp mẫu trực tiếp hoặc nối với đầu ra của một thiết bị phân tích khác như sắc ký khí, sắc ký lỏng siêu giới hạn (SFC), điện di mao quản (CE). . .
Hình 1.1. Sơ đồ khối của máy khối phổ
Hình 1.1 mô tả sơ đồ khối của một máy khối phổ, gồm 5 bộ phận sau:
1.3.2.2. Bộ nguồn ion (Ion source)
Ion hoá các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi, khử dung mơi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối, cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển với bộ phận nằm trong chân khơng sâu, và rút ra ngồi các phân tử trung hịa, ion khác dấu có thể ảnh hưởng đến phép đo.
Các kỹ thuật ion hóa đã được phát triển và sử dụng là: Va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa bằng nguồn ion phun sương khử solvat, ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển, ion hóa bởi nguồn ion bằng giải hấp.
Kỹ thuật sử dụng trong luận văn này là ion hóa bằng nguồn ion phun sương khử solvat hay gọi tắt là kỹ thuật ion hóa bằng phun điện tử - Electronspray ionization, ESI.
1.3.2.3. Bộ phân tích khối (Mass Analyzer)
Tách các ion theo tỷ số m/z. Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector. Cú thể phân bộ phân tích khối thành 4 loại:
- Bộ phân tích từ (Magnetic Analyser) - Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole)
- Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser-TOF)
- Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron (Ion cyclotron resonance
Bộ nạp
mẫu Nguồn
ion tích khốiBộ phân Detector
Xử lý số liệu số liệu
analyser-ICR).
Đề tài này chúng tơi sử dụng máy khối phổ có bộ phân tích khối là bộ phân tích tứ cực chập ba.
Bộ tứ cực chập ba (Triple Quadrupole Analyser): Bộ phân tích khối
gồm ba bộ tứ cực nối tiếp nhau. Bộ Q1 và Q3 làm nhiệm vụ phân tích khối, bộ Q2 làm nhiệm vụ va chạm ion để phân tách thành các mảnh khối nhỏ hơn, đó là ion con. Sơ đồ bộ tứ cực chập ba được trình bày ở hình 1.2.
Hỡnh 1.2. Sơ đồ bộ tứ cực chập ba
Bộ phân tích tứ cực chập 3 cịn được gọi là Tandem Mass Analyser. Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này là khối phổ 2 lần (MS/MS). Kỹ thuật này thường được dựng để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần chưa được tinh chế sạch.
1.3.2.4. Detector
Detector có nhiệm vụ chuyển các ion đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ. Hiện có 2 dạng truyền thống:
- Nhân electron (electron multiplier). - Nhân quang (photomultiplier)
Trong luận văn này, bộ phận phát hiện ion là dạng nhân quang.
1.3.2.5. Bộ xử lý dữ liệu (Data System)
Tín hiệu điện từ detector được khuyếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ khối, so sánh với thư viện phổ, định lượng...
1.3.3. Một số kỹ thuật LC-MS