2.1.2.9. Định tớnh cyclodextrin bằng phương phỏp sắc ký bản mỏng (TLC)
* Dung cụ và húa chất:
- Bản mỏng silica gel 60 F254 (Đức)
- Hỗn hợp dung mụi: 1-propanol : ethylacetate : nước : dung dịch amonia 25% = 6 : 2 : 5: 3 (v/v)
- Thuốc hiện màu: dung dịch 1% mathnolic iot. Dựng bơm phun thuốc hiện màu lờn bản sắc ký sau khi chạy xong
- Chất chuẩn: α-, β-, γ-CD
* Tiến hành:
Dựng thước và bỳt chỡ kẻ vạch một đường ngang trờn mặt phải của bản mỏng, cỏch mộp dưới của 1 cm. Trờn đường kẻ này chấm những chấm bằng bỳt chỡ để nhỏ mẫu, mỗi chấm cỏch nhau 1 cm.
Dựng micropipet nhỏ dung dịch mẫu chuẩn và dung dịch mẫu cần phõn tớch vào chỗ chấm trờn bản mỏng (tiến hành ớt nhất 3 lần chấm) và để khụ. Chạy sắc ký: Đặt bản mỏng vào bỡnh đựng dung mụi sao cho mặt dung mụi cỏch điểm chấm mẫu khoảng 0,5 cm. Đậy kớn nắp bỡnh dung mụi. Để
dung mụi chạy cho đến khi cỏch mộp trờn bản mỏng khoảng 2 cm thỡ lấy ra
để khụ.
Phun dung dịch hiện màu tỏa đều khắp mặt bản mỏng, để khụ rồi sấy ở
nhiệt độ 1050C trong 5 phỳt để hiện màu.
α-CD cho màu đỏ tớa, β-CD cho màu vàng, γ-CD cho màu vàng nhạt So sỏnh mẫu chuẩn với mẫu thớ nghiệm. Nếu ở mẫu thớ nghiệm cú vết màu chạy ngang với mẫu chuẩn thỡ mẫu thớ nghiệm cú chứa CD, ngược lại thỡ khụng chứa CD.
2.1.2.10. Xỏc định độ trong của dịch đường bằng phương phỏp đo OD ởbước súng 230 nm [28] bước súng 230 nm [28]
2.1.2.11. Xỏc định cỏc ion kim loại bằng phương phỏp húa học (phõn tớch lương thực thực phẩm – 1974) lương thực thực phẩm – 1974)
- Ion canxi: dựa trờn cơ sở mụi trường kiềm yếu, ion canxi tạo tủa (oxalat canxi) với thuốc thử (NH4)2C2O4ở mụi trường kiềm yếu.
- Ion Clo: phương phỏp chuẩn độ bằng bạc nitrat (0,1N) tạo tủa bạc clorua - Ion Sắt: theo phương phỏp tạo phức dựng NH4CNS tạo phức đỏ với Fe3+
Sb – Sd
Hs(%) = x 100
Sb
Trong đú:
Hs : Hiệu suất chuyển hoỏ đường sacaroza (%)
Sb : Lượng đường sacaroza ban đầu đưa vào gắn kết (g) Sd : Lượng đường sacaroza cũn dư sau quỏ trỡnh gắn kết (g)
2.1.2.13. Xỏc định hiệu suất chuyển húa tinh bột
TBb – DE– Dc
Htb(%)= x 100
TBb
Trong đú:
Htb : Hiệu suất chuyển hoỏ tinh bột (%) TBb : Lượng tinh bột ban đầu (g)
DE: Lượng đường khử cũn lại sau quỏ trỡnh gắn kết Dc : Lượng dextrin cũn lại sau quỏ trỡnh gắn kết (g)
2.1.2.14. Xỏc định cỏc thành phần đường trong sản phẩm oligoglucosyl fructoza bằng phương phỏp HPLC. fructoza bằng phương phỏp HPLC.
Điều kiện chạy HPLC: Loại cột: LC-NH2 (Supelco); Tốc độ dũng: 1 ml/min; Nhiệt độ cột: 400C; Detector: RI (Refactive Index); Mobile phase: Acetonitril : nước = 70 : 30.
2.1.2.15. Xỏc định maltosyl fructoza và maltotriosyl fructoza, maltotetraosyl fructoza bằng phương phỏp HPLC. maltotetraosyl fructoza bằng phương phỏp HPLC.
Điều kiện chạy: Loại cột: Pb (Supelco); Tốc độ dũng: 0,5 ml/min; Nhiệt độ cột: 800C; Detector: RI (Refactive Index); Mobile phase: nước.
2.1.2.16. Phõn tớch kiểm tra vi sinh vật:
- Kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khớ (TCVN 5165-90) - Kiểm tra coliform và E.coli (TCVN 6505-99)
- Kiểm tra Clostridium perfringens (TCVN 4991-2005)
2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, NGUYấN VẬT LIỆU VÀ HOÁ CHẤT
2.2.1. NGUYấN LIỆU.
* Tinh bột sắn(Việt Nam) cú chất lượng như sau: - Hàm lượng tinh bột : ≥ 85%
- Độẩm: 12 - 13% - Độ tro: 0,5 – 0,6 % - pH: 5 - 7
* Đường sacaroza – Việt Nam
* Đường coupling sugar của Nhật dạng siro.
* Enzim dịch húa: Enzim AmylexđHT (Mỹ) thuộc loại α-amylaza chịu nhiệt, là một loại enzim dịch húa mới cú trờn thị trường.
* Enzim gắn kết tạo đường “coupling sugar”:
- Toruzyme 3.0L (3 KNU/g) (Novoenzim - Đan Mạch). Đõy là chế
phẩm enzim dạng lỏng, màu nõu, cú tỷ trọng xấp xỉ 1,2 g/ml. Chế phẩm Toruzyme 3.0L chứa CGTaza bền nhiệt sản xuất từ chủng Bacillusđược biến
đổi gen (nhận gen từ chủngThermoanaerobacter). pH tối ưu 5,5 – 6,5; nhiệt
độ hoạt động tối ưu ở 55 - 600C.
- Cyclodextrin glucanotransferaza (EC.2.4.1.19, CGTaza) (Amano – Nhật Bản) được sản xuất trong quỏ trỡnh lờn men chủng Bacillus macerans. Chế phẩm enzim dạng dịch, cú màu nõu nhạt, pH tối ưu: 6,0; nhiệt độ hoạt
động tối thớch ở 60 - 650C * Than hoạt tớnh (Nhật) * Nhựa trao đổi ion (Nhật)
2.2.2. HOÁ CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ2.2.2.1. Húa chất. 2.2.2.1. Húa chất.
* CuSO4.5H2O, KNaC4H4O6, NaOH, HCl, K3Fe(CN) 6,…. – Trung Quốc * 1-propanol, ethylacetate, dung dịch amonia 25%,... – Nhật Bản
* Hoỏ chất chạy HPLC: cỏc loại đường chuẩn: glucoza, sacaroza, maltoza, fructoza, CD, maltosyl fructoza, maltotriosyl fructoza, maltotetraosyl fructoza và dung mụi chạy sắc ký.
* Iốt, xanh metylen, cồn tuyệt đối, Bản silica gel 60 TLC (Đức),…
* Thành phần mụi trường kiểm tra vi sinh vật (Cao thịt, pepton, cao nấm men, glucoza, cỏc loại muối,...)
2.2.2.2. Thiết bị, dụng cụ.
+) Mỏy sắc ký lỏng cao ỏp – Nhật Bản + Nồi cỏch thủy (Memmert - Đức) +) Chiết quang kế - Nhật Bản +) Bome kế - Đức
+) Mỏy đo pH Orion, Model 410 - Mỹ
+) Mỏy đo độ nhớt Brookfield - Đức +) Mỏy đo độẩm Precisa HA60 - Thụy Sĩ
+) Mỏy cụ chõn khụng Yamoto RE 400 - Nhật Bản +) Mỏy so mầu UV 1601PC- Nhật Bản
+) Tủ sấy hồng ngoại - Nhật Bản + Tủ sấy Sanyo – Nhật Bản +) Tủ cấy VSV
+) Bỡnh tam giỏc, bỡnh định mức, cốc thủy tinh, ống đong,. +) Nhiệt kế, pipet, buret, phễu thủy tinh, bỡnh chạy sắc ký TCL
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIấN CỨU THỦY PHÂN TINH BỘT LÀM NGUYấN LIỆU CHO QUÁ TRèNH SẢN XUẤT ĐƯỜNG OLIGOGLUCOSYL FRUCTOZA QUÁ TRèNH SẢN XUẤT ĐƯỜNG OLIGOGLUCOSYL FRUCTOZA
Quỏ trỡnh gắn kết tinh bột với đường sacaroza để tạo đường olygoglucosyl fructoza bằng enzim được chia thành hai giai đoạn. Giai đoạn
đầu là quỏ trỡnh dịch hoỏ tinh bột, tiếp theo là giai đoạn gắn kết. Giai đoạn dịch hoỏ nhằm mục đớch làm tinh bột bị mất đi cấu trỳc tinh thể, bị thuỷ phõn tạo thành cỏc oligosaccarit dễ tan trong nước, giỳp enzim dễ dàng hoạt động trong giai đoạn gắn kết. Mặt khỏc, trong dịch thuỷ phõn phải cú hàm lượng
đường khử thấp bởi nếu đường khử cao thỡ cho hiệu suất gắn kết thấp nhưng nếu thấp quỏ thỡ trong quỏ trỡnh gắn kết một phần sẽ bị vũng hoỏ tạo cyclodextrin (CD). Vỡ vậy, yờu cầu đặt ra trong quỏ trỡnh dịch hoỏ tinh bột phải được thuỷ phõn hoàn toàn thành cỏc oligosaccarit, và cú hàm lượng
đường khử thấp nhưng khụng cú khả năng vũng hoỏ tạo CD.
3.1.1. NGHIấN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỨC ĐỘ THỦY PHÂN TINH BỘT ĐẾN QUÁ TRèNH GẮN KẾT. QUÁ TRèNH GẮN KẾT.
Trước khi nghiờn cứu cỏc điều kiện thuỷ phõn tinh bột làm nguyờn liệu cho cho quỏ trỡnh gắn kết giữa tinh bột và sacaroza thỡ phải nghiờn cứu thủy phõn tinh bột đến mức độ nào để lựa chọn được giỏ trị DE thớch hợp cho quỏ trỡnh gắn kết. Giỏ trị DE thấp dễ bị vũng hoỏ tạo CD, nếu DE cao ảnh hưởng
đến hiệu suất gắn kết. Do vậy trong thớ nghiệm này, chỳng tụi muốn tỡm giỏ trị DE trong quỏ trỡnh dịch hoỏ thấp nhất nhưng phải thoả món khụng tạo CD trong quỏ trỡnh gắn kết.
Điều kiện thớ nghiệm: Từ tinh bột sắn (với nồng độ bột 10%) tiến hành dịch húa tạo ra cỏc giỏ trị DE khỏc nhau. Sau đú bổ sung đường
nồng độ chất khụ), nhiệt độ gắn kết 550C trong 24 giờ. Kiểm tra sự tạo thành CD bằng phương phỏp sắc ký bản mỏng, kết quảđược thể hiện trong bảng 3.1 và hỡnh sắc ký đồ (xem phần phụ lục). Bảng 3.1. Ảnh hưởng của DE dịch hoỏ đến khả năng tạo CD trong quỏ trỡnh gắn kết TT DE Độ nhớt (cp) CD 1 5 20 ++ 2 7 15 ++ 3 9 12 ++ 4 11 10 + 5 13 9 + 6 15 7 - ( Chỳ thớch: + là cú CD; - là khụng cú CD)
Qua bảng 3.1 cho thấy nếu chỉ số DE ≤ 13 quỏ trỡnh gắn kết một phần oligosaccarit vũng hoỏ tạo thành CD, dẫn đến hiệu suất gắn kết sẽ thấp, sản phẩm bị đục. Nếu DE ≥15, quỏ trỡnh gắn kết khụng tạo thành CD, sản phẩm khụng bị đục, hiệu suất gắn kết sẽ cao hơn, mặt khỏc độ nhớt thấp hơn sẽ dễ
dàng cho quỏ trỡnh thu hồi sản phẩm sau này. Vỡ vậy, chỳng tụi chọn dịch thuỷ phõn cú DE 15 để nghiờn cứu tiếp.
3.1.2. NGHIấN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN THUỶ PHÂN TINH BỘT ĐỂ TẠO DỊCH THUỶ PHÂN Cể DE 15 THUỶ PHÂN Cể DE 15
3.1.2.1. Nghiờn cứu ảnh hưởng của nồng độ enzim dịch hoỏ đến quỏ trỡnh thủy phõn tinh bột tạo dịch DE 15 thủy phõn tinh bột tạo dịch DE 15
Nồng độ enzim là một yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ và hiệu suất của phản ứng enzim. Vỡ vậy, việc xỏc định được một liều lượng enzim trong quỏ trỡnh dịch hoỏ sao cho đạt được mục đớch đó đặt ra đối với quỏ trỡnh này là một điều cần thiết.
Thớ nghiệm được tiến hành như sau: nồng độ bột 10%, nhiệt độ thủy phõn 850C, thời gian thủy phõn 15 phỳt, pH 6, nồng độ enzim được thử từ
0,01- 0,05% (so với nồng độ cơ chất)
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzim đến quỏ trỡnh thủy phõn tinh bột tạo dịch thuỷ phõn DE 15 TT Nồng độ enzim (%) Nồng độ chất khụ (0Bx) DE 1 0,01 9,1 8,5 2 0,02 9,8 12,3 3 0,03 9,9 15,4 4 0,04 9,9 18,2 5 0,05 9,9 21,0
Qua bảng 3.2 cho thấy, nồng độ enzim tỷ lệ thuận với giỏ trị DE. Nồng
độ enzim tăng thỡ DE cũng tăng và với nồng độ enzim là 0,03% cho kết quả
tốt nhất, dịch bột đó được thủy phõn hoàn toàn, giỏ trị DE đạt 15,4 đỏp ứng yờu cầu đặt ra. Do vậy, chỳng tụi chọn nồng độ enzim thớch hợp cho quỏ trỡnh thủy phõn tinh bột để tạo dịch DE 15 là 0,03% (so với nồng độ tinh bột).
3.1.2.2. Xỏc định nồng độ tinh bột thớch hợp cho quỏ trỡnh dịch húa tạo dịch DE 15
Nồng độ tinh bột là một yếu tố xỏc định năng suất và giỏ thành sản phẩm. Sử dụng được dịch bột cú nồng độ cao cho phộp giảm lượng nước sử
dụng cũng như chi phớ trong quỏ trỡnh chuyển hoỏ và thu hồi sản phẩm. Tuy nhiờn, nồng độ tinh bột cũn ảnh hưởng đến khả năng dịch húa của enzim cũng nhưđộ nhớt của dịch thủy phõn thu được. Ảnh hưởng này được xỏc định bằng cỏch thay đổi nồng độ dịch bột đem dịch húa từ 5 - 30% (w/v). Cỏc mẫu thớ nghiệm được tiến hành dịch húa ở điều kiện pH 6,0, nhiệt độ 85oC, thời gian 15 phỳt, enzim dịch húa là Amilex HT với nồng độ 0,03%.
Cỏc mẫu sau khi dịch hoỏ được xỏc định nồng độ chất khụ, DE, độ
nhớt. Kết quảđược trỡnh bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3. Tớnh chất của dịch thủy phõn tinh bột ở cỏc nồng độ tinh bột khỏc nhau Dịch sau dịch hoỏ Nồng độ tinh bột (% w/v) Nồng độ chất khụ (Bx) DE Độ nhớt (cp) 5 4,9 15,4 6 10 9,9 15,3 8 15 14,5 13,7 9 20 19,1 12,2 12 25 23,9 10,7 17 30 28,3 10,1 25
Kết quả cho thấy, nồng độ tinh bột cú ảnh hưởng rừ rệt đến DE cũng nhưđộ nhớt của dịch thuỷ phõn thu được:
Nồng độ tinh bột tăng từ 5 - 30%, DE của dịch thủy phõn thu được giảm đều và chậm dần. Điều đú chứng tỏ, khi tăng nồng độ tinh bột, tỷ lệ cỏc phõn tử tinh bột được thủy phõn thành đường khử sẽ giảm đi. Điều này được giải thớch là do ở nồng độ tinh bột thấp, dịch tinh bột loóng, enzim tiếp xỳc dễ
dàng hơn với cơ chất vỡ vậy cú thể phõn cắt mạch tinh bột một cỏch sõu hơn là khi dịch tinh bột ở nồng độ cao.
Trong khoảng nồng độ tinh bột từ 5 - 20% thỡ độ nhớt của dịch thủy phõn nhận được tăng đều. Điều này cú hai lớ do: một là độ nhớt của dịch vốn sẽ cao hơn khi nồng độ chất khụ của nú cao hơn, hai là hoạt tớnh dịch húa của enzim giảm khi nồng độ cơ chất tăng. Nhưng khi nồng độ tinh bột tăng đến 25 - 30%, độ nhớt của dịch thủy phõn thu được tăng mạnh. Điều đú chứng tỏ lỳc này, hoạt tớnh thủy phõn tinh bột của enzim trở nờn giảm đi rất nhiều. Vỡ vậy,
khi dịch húa, nồng độ tinh bột khụng nờn quỏ 20%, và đểđỏp ứng với yờu cầu
đặt ra chỳng tụi chọn nồng độ bột 10% là phự hợp nhất.
3.1.2.3. Nghiờn cứu ảnh hưởng của nhiệt độ trong quỏ trỡnh thủy phõn tinh bột tạo dịch DE 15.
Nhiệt độ cũng là một yếu tốảnh hưởng đến hoạt tớnh thuỷ phõn tinh bột của enzim. Mỗi enzim cú một nhiệt độ hoạt động tối ưu khỏc nhau. Vỡ vậy để
tăng hiệu quả trong sản xuất cần xỏc định nhiệt độ thớch hợp cho enzim. Trong quỏ trỡnh sản xuất cần duy trỡ nhiệt độổn định trong thời gian xỏc định.
Điều kiện thớ nghiệm: Nồng độ bột 10%, nồng độ enzim 0,03%, thời gian thủy phõn 15 phỳt, pH 6, nhiệt độ thủy phõn được thử từ 70 - 950C. Kết quảđược thể hiện trong bảng 3.4
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quỏ trỡnh thủy phõn tinh bột tạo dịch DE 15 TT Nhiệt độ (0C) Nồng độ chất khụ (0Bx) DE 1 70 6,2 5,5 2 75 7,7 6,7 3 80 9,4 12,6 4 85 9,9 15,4 5 90 9,9 15,3 6 95 9,5 13,0
Theo quy luật cỏc phản ứng hoỏ học thụng thuờng, nhiệt độ càng cao thỡ vận tốc phản ứng càng tăng. Ở nhiệt độ càng cao thỡ độ nhớt càng giảm. Tuy nhiờn do enzim cú bản chất của protein nờn ở nhiệt độ quỏ cao, protein bị
biến tớnh, làm hoạt tớnh của enzim giảm hẳn và khụng hoạt động trở lại được.
Ở nhiệt độ 70-80oC hoạt động thuỷ phõn chưa đạt mức cao nhất. Ở nhiệt độ
tới ngưỡng của nhiệt độ bất hoạt enzim, nờn hiệu suất thuỷ phõn bắt đầu giảm. Vỡ vậy, chỳng tụi chọn nhiệt độ thủy phõn là 85 - 900C để tiến hành nghiờn cứu tiếp theo.
3.1.2.4. Nghiờn cứu ảnh hưởng của thời gian thủy phõn tinh bột tạo dịch DE 15
Trong quỏ trỡnh thủy phõn, thời gian đúng vai trũ rất quan trọng nếu thời gian dịch húa quỏ dài hoặc quỏ ngắn đều ảnh hưởng đến chất lương sản phẩm và giỏ thành sản phẩm. Vỡ vậy, trong thớ nghiệm này chỳng tụi tiến hành thửảnh hưởng của thời gian đến quỏ trỡnh dịch húa.
Thớ nghiệm được tiến hành với điều kiện như sau: Nồng độ cơ chất: 10%; nhiệt độ dịch hoỏ: 850C; pH6; nồng độ enzim: 0,03%; thời gian dich húa được thử từ : 5 - 25 phỳt. Kết quảđược ghi trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian thủy phõn tinh bột tạo dịch bột DE 15 TT Thời gian (phỳt) Nồng độ chất khụ (0Bx) DE 1 5 9,5 13,1 2 10 9,9 14,9 3 15 9,9 15,5 4 20 9,9 16,1 5 25 9,9 16,3
Thời gian thuỷ phõn càng kộo dài, DE của dịch thuỷ phõn tăng chậm dần theo thời gian, và sau 20 phỳt dịch hoỏ, chỉ số DE tăng khụng đỏng kể, trong khi đú lượng tinh bột đó được thuỷ phõn hoàn toàn sau 10 - 15 phỳt. Như vậy, kộo dài thời gian dịch hoỏ quỏ mức chỉ làm tăng lượng đường khử
tạo ra trong dịch.
Qua bảng trờn ta thấy với thời gian thủy phõn 10– 15 phỳt cho giỏ trị
DE nằm trong khoảng cho phộp. Do vậy, chỳng tụi chọn thời gian dịch hoỏ 10 phỳt là phự hợp nhất.
3.1.2.5. Nghiờn cứu ảnh hưởng của pH đến quỏ trỡnh thủy phõn tinh bột tạo dịch DE 15
Mỗi enzim đều cú pH hoạt động thớch hợp, tại pH thớch hợp enzim hoạt
động mạnh nhất. Quỏ trỡnh dịch hoỏ tinh bột được tiến hành với chế độ như
sau:
Nồng độ cơ chất là : 10% Nồng độ enzym : 0,03%; Nhiệt độ dịch húa: 85oC. Thời gian dịch hoỏ : 10 phỳt.
Thay đổi giỏ trị pH từ : 5,0 – 7,5 để xỏc định mức độ ảnh hưởng của pH
đến quỏ trỡnh thuỷ phõn tinh bột. Kết quảđược thể hiện qua bảng 3.6
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH đến quỏ trỡnh thủy phõn tinh bột tạo dịch DE 15