2. TỔNG QUAN
2.3.1. Phản ứng mantoux
Cho đến nay, chẩn đoỏn lao ở trẻ em vẫn dựa vào nhiều dữ liệu, trong đú kết quả thử nghiệm trong da (phản ứng mantoux) là một trong cỏc dữ liệu quan trọng. Phản ứng mantoux là thử nghiệm tiờm trong da một lượng khỏng nguyờn hoà tan (tuberculin), là cỏc protein tinh chế chiết xuất (PPD) từ nước nổi nuụi cấy M. tuberculosis. Kết quả được đọc sau 72 giờ với số đo đường kớnh vựng cục sần nơi tiờm.
Tuỳ thuộc vào điều kiện mụi trường và mức độ tiếp xỳc với cỏc
Mycobacteria ở mụi trường, kết quả của phản ứng mantoux được đỏnh giỏ theo nhiều mức độ. Kết quảđược coi là dương tớnh nếu sốđo đường kớnh nốt sần từ 10mm trở lờn ở những người chưa được tiờm BCG hoặc sống trong cỏc vựng khụng phơi nhiễm nhiều với cỏc Mycobacteria ngoại cảnh.
Năm 1990, Hội lồng ngực Mỹ [19] đó đưa ra cỏc mức độđỏnh giỏ như sau:
- Sốđo đường kớnh nốt sần khoảng ≥5mm được coi là dương tớnh nếu đối tượng đang tiếp xỳc với nguồn lõy là trường hợp lao phổi tiến triển, người nhiễm HIV hoặc cú nguy cơ nhiễm HIV cao, người cú hỡnh ảnh X-quang xơ hoỏ của lao phổi cũ;
- Số đo đường kớnh nốt sần ≥10mm được coi là dương tớnh đối với cỏc đối tượng cú nguy cơ mắc lao cao (tiờm chớch ma tuý HIV (-), tiểu đường, suy thận món, cỏc bệnh lý về mỏu, bệnh ỏc tớnh,v.v; cỏc đối tượng đang sống trong cỏc nhà tự, trại trẻ mồ cụi, nhà dưỡng lóo, trẻ tiếp xỳc trực tiếp với nguồn lõy… ).
- Sốđo đường kớnh nốt sần ≥15mm: dương tớnh đối với những trường hợp cũn lại.
Độ nhạy và độ đặc hiệu của thử nghiệm này khụng ổn định và bị phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Độ nhạy dao động từ 75-90% và độđặc hiệu chỉ 70-
95% [26], [68]. Với cỏc đối tượng chưa từng được tiờm chủng BCG ở những nơi cú tỉ lệ bệnh lao thấp thỡ độ nhạy của phản ứng này đạt đến 87% và độ đặc hiệu là 80% [31].
2.3.2. Phỏt hiện và phõn lập tỏc nhõn gõy bệnh.
Xột nghiệm phũng thớ nghiệm cú vai trũ quan trọng nhất trong chẩn đoỏn trực tiếp tỏc nhõn gõy bệnh lao ở người lớn là nhuộm soi kớnh trực tiếp và nuụi cấy mẫu đờm. Nhưng đối với trẻ em, mẫu bệnh phẩm để nuụi cấy tốt nhất là dịch rửa dạ dày sỏng sớm, trước khi trẻ thức dậy vỡ tớch luỹđược dịch tiết được trẻ nuốt trong đờm [29]. Tuy nhiờn, dự cú lấy được 3 mẫu dịch dạ dày trong điều kiện tối ưu, chỉ cú khoảng 20-50% trường hợp cú kết quả dương tớnh. Kết quả nuụi cấy õm tớnh khụng loại trừđược lao ở trẻ em. Đối với trẻ dưới 1 tuổi, tỉ lệ này chỉ đạt được dưới 10% tổng số trường hợp. Đối với trẻ lớn tuổi hơn, cú thể lấy mẫu dịch rửa phế nang bằng kớch thớch ho để nuụi cấy song kết quả cũng hạn chế [29].
Do vậy, đối với trẻ em cú kết quả thử mantoux dương tớnh, kết quả lõm sàng hoặc chụp X-quang cho thấy nghi lao, cú tiền sử tiếp xỳc với người lớn mắc lao, cần điều trị lao cho trẻ. Cú thể tham khảo kết quả thử tớnh nhạy cảm với thuốc chống lao của người lớn mà trẻ tiếp xỳc để xỏc định phỏc đồ điều trị thớch hợp cho trẻ.
Hiện nay, một số kỹ thuật phũng thớ nghiệm được ỏp dụng để tăng cường khả năng chẩn đoỏn cỏc thể lao khú chẩn đoỏn như lao ngoài phổi, lao phổi AFB õm tớnh, lao trẻ em. Đú là cỏc kỹ thuật huyết thanh học tỡm khỏng nguyờn hiện diện trong cỏc mẫu dịch tiết của trẻ hoặc khỏng thểđặc hiệu với
M. tuberculosis và cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử như phản ứng khuếch đại chuỗi polymeraza (PCR), spoligotyping sử dụng cỏc thụng tin về trỡnh tự DNA đặc hiệu cho nhúm vi khuẩn lao như IS6110, cú độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong phỏt hiện DNA tương ứng của trực khuẩn M. tuberculosis
2.3.3. Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR)
PCR chẩn đoỏn sử dụng trỡnh tự DNA đặc hiệu của vi khuẩn để phỏt hiện sự cú mặt của vi khuẩn đú trong bệnh phẩm. Theo lý thuyết, kỹ thuật này cú thể phỏt hiện một tế bào vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm đờm, dịch dạ dày, dịch màng phổi, dịch nóo tuỷ hoặc mỏu. Cỏc số liệu nghiờn cứu cho thấy hầu hết kỹ thuật PCR chẩn đoỏn lao sử dụng trỡnh tự IS6110 như dấu ấn DNA đối với vi khuẩn thuộc nhúm M. tuberculosisđều cú độ nhạy và độ đặc hiệu lớn hơn 90% khi phỏt hiện lao phổi ở người lớn [65]. PCR cú thể cú vai trũ lớn trong chẩn đoỏn lao ngoài phổi và lao phổi trẻ em.
Pierre và cộng sự [70] đó sử dụng PCR dựa trờn IS6110 để phỏt hiện
M. tuberculosis trong dịch dạ dày của 22 trẻ mắc lao phổi, kết quả cho thấy 15 trong số 59 (25%) mẫu dương tớnh. Độ nhạy cú thể gia tăng nếu lặp lại thử nghiệm hai lần. Khi lặp lại PCR hai lần với 3 bệnh phẩm của cựng một bệnh nhi, cú 9/15 bệnh nhi cú ≥ 2 mẫu dương tớnh, khụng cú mẫu nào của 17 bệnh nhi kiểm chứng dương tớnh. Starke và cộng sự. [84] sử dụng PCR dựa trờn IS6110 phõn tớch dịch dạ dày của 35 trẻ nằm viện mắc lao phổi và 30 trẻ đối chứng để phỏt hiện M. tuberculosis. So với chẩn đoỏn lõm sàng, PCR cú độ nhạy đạt 40% và độđặc hiệu đạt 80%. Delacourt và cộng sự [38] nghiờn cứu 199 mẫu bệnh phẩm từ 68 trẻ nghi ngờ mắc lao sử dụng PCR phỏt hiện
M. tuberculosis, kết quả cho thấy 83% mẫu dương tớnh, cao hơn nhiều so với kết quả soi kớnh tỡm AFB (21%) và kết quả nuụi cấy dương tớnh (42%) [38]. Ở Việt Nam, một số nhúm nghiờn cứu đó đỏnh giỏ hiệu quả sử dụng PCR để phỏt hiện M. tuberculosis ở bệnh nhõn nghi mắc lao và kết quả cho thấy PCR thật sự cú ớch trong chẩn đoỏn hỗ trợ cỏc thể lao AFB õm tớnh, lao ngoài phổi và lao trẻ em [7, 12, 13, 15].
2.3.4. Phương phỏp huyết thanh học và phỏt hiện khỏng nguyờn
Cỏc phương phỏp huyết thanh học cho đến nay vẫn ớt được sử dụng trong chẩn đoỏn lao người lớn và trẻ em. Hussey và cộng sự [48] đó sử dụng
khỏng nguyờn M. tuberculosis toàn phần hấp ướt để phỏt hiện khỏng thể đặc hiệu trong huyết thanh của 132 trẻ mắc lao phổi lõm sàng, kết quả cho thấy độ nhạy đạt 62% và độđặc hiệu đạt 98%. Độ nhạy của phương phỏp gia tăng trong nhúm bệnh nhõn cú kết quả nuụi cấy dương tớnh (69%, n = 35), lao kờ (100%, n = 6), lao màng nóo (80%, n = 15), và lao tràn dịch màng phổi (78%, n = 16). Kết quả này khụng tương quan với kết quả thử nghiệm trong da, tiờm BCG hoặc tỡnh trạng dinh dưỡng của trẻ, nhưng tương quan với độ dài thời gian điều trị, tuổi, tỡnh trạng món tớnh của bệnh. Delacourt và cộng sự. [37] đó sử dụng ELISA phỏt hiện khỏng thể IgG và IgM đặc hiệu với khỏng nguyờn A60 ở trẻ mắc lao. Với độđặc hiệu 98%, IgG được phỏt hiện ở 68% trẻ cú bệnh lý lõm sàng. IgM được phỏt hiện ở 19% bệnh nhi.
Kỹ thuật phỏt hiện khỏng nguyờn Mycobacteria được chỳ ý nghiờn cứu đỏnh giỏ trờn bệnh phẩm lõm sàng người lớn, nhưng chưa được thực hiện nhiều ở trẻ em [87]. Một số kỹ thuật phỏt hiện axit tuberculostearic dựa trờn nguyờn tắc sắc ký [27] được phỏt triển cú độ nhạy và độ đặc hiệu khỏ cao (95% và 91%) đối với chẩn đoỏn lao người lớn, song với lao trẻ em chưa cú số liệu và kỹ thuật phức tạp nờn ứng dụng chưa nhiều.
2.3.5. Hệ thống cộng điểm lõm sàng
Do tớnh chất khú khăn của chẩn đoỏn lao, đặc biệt lao ở trẻ em, nhiều hệ thống cộng điểm đó được đề nghị sử dụng dựa trờn cỏc thụng tin sẵn cú và kết quả xột nghiệm. Mặc dự biện phỏp này cú độ nhạy và độ đặc hiệu thấp, ngay cả cỏc nước phỏt triển, việc sử dụng kết quả tiờm trong da dương tớnh, hỡnh ảnh x-quang bất bỡnh thường, tiền sử tiếp xỳc với người lớn bị mắc lao vẫn là biện phỏp được sử dụng nhiều trong chẩn đoỏn lao ở trẻ em.
• Cỏc tiờu chuẩn chẩn đoỏn lao phổi ở trẻ em của Tổ chức Y tế Thế giới (xem phần Phụ lục)
- đang ốm, cú tiền sử tiếp xỳc với trường hợp nghi hoặc được chẩn đoỏn khẳng định là mắc lao phổi;
- khụng phục hồi bỡnh thường sau khi mắc sởi hoặc ho gà;
- sụt cõn, ho, bị sốt đó uống khỏng sinh điều trị bệnh hụ hấp cấp nhưng khụng khỏi;
- cú triệu chứng đau bụng, đi ngoài nhiều; - cú hạch ngoại vi mềm khụng đau;
- cú dấu hiệu viờm nóo hoặc bệnh hệ thống thần kinh trung ương.
2.4. Một vài nột về khu vực đồng bằng Bắc bộ
Đồng bằng Bắc bộ trước đõy gồm 9 tỉnh/thành phố, nay gồm 11 tỉnh/thành phố đú là Bắc Ninh, Hà Nam, Hà Nội, Hà Tõy, Hải Dương, Hải Phũng, Hưng Yờn, Nam Định, Ninh Bỡnh, Thỏi Bỡnh, Vĩnh Phỳc (Tài liệu thống kờ năm 2007). Đồng bằng Bắc bộ cũn gọi là Đồng bằng sụng Hồng, là vựng đồng bằng chõu thổ của sụng Hồng, miền Bắc Việt Nam. Đồng bằng sụng Hồng là một trong 3 tiểu vựng của Bắc Bộ Việt Nam (2 tiểu vựng kia là Vựng Đụng Bắc và Vựng Tõy Bắc).Vựng đồng bằng sụng Hồng nằm ngay cạnh phớa Nam của đường bắc chớ tuyến, giữa vĩ độ 22°00' và 21°30' Bắc và kinh độ 105°30' và 107°00' Đụng. Nú cú hỡnh dỏng điển hỡnh của một vựng chõu thổ, với đỏy là đường bờ biển kộo dài 130 km từ trung tõm mỏ than và cảng thành phố Hạ Long ở phớa Bắc, đến điểm cực Nam của tỉnh Ninh Bỡnh ở phớa Nam. Tổng diện tớch của vựng đồng bằng Bắc bộ khoảng 14.806 km2. Mật độ dõn cư ở đồng bằng chõu thổ sụng Hồng cao nhất Việt Nam (1.225 người/km²) (Số liệu thống kờ năm 2006). Tổng dõn số của vựng là 17.649.700 người (số liệu thống kờ năm 2003). Do đặc điểm đụng dõn cư, mật độ dõn cư cao, khớ hậu núng ẩm, nờn tỡnh hỡnh cỏc bệnh nhiễm khuẩn ở khu vực Đồng bằng Bắc bộ thường cú những nột đặc trưng về tớnh chất và mức độ của khu vực nhiệt đới. Nguy cơ nhiễm và mắc lao cũng khụng ngoại lệ, tuy thấp hơn so với ở miền Trung và miền Nam, song vẫn là một trong
những vấn đề cần quan tõm của ngành y tế hiện nay. Bốn (04) tỉnh trong số này (Hải Dương, Hưng Yờn, Vĩnh Phỳ và Thỏi Bỡnh) là địa điểm của nghiờn cứu, với đặc điểm đụng dõn cư (Theo số liệu thống kờ năm 2007, Hải Dương: cú dõn số 1.732.800 người với mật độ trung bỡnh 1.048/1km; Hưng Yờn: 1.156.500 người, mật độ dõn số trung bỡnh 1.252/km; Vĩnh Phỳc: 1.190.000 người, mật độ dõn số trung bỡnh 149/km; Thỏi Bỡnh: 1.868.800 người, mật độ dõn số là 1.208/km), là cỏc tỉnh nằm dọc theo đường quốc lộ số 1 của đất nước, do vậy cú thể đại diện cho tỡnh hỡnh mắc lao của cả khu vực.
Tại một số tỉnh ở khu vực đồng bằng Bắc bộ như Hưng Yờn, kết quả điều tra năm 2000 ở 20 xó, phường thuộc 6 huyện, thị cho thấy tỉ lệ mắc lao phổi AFB dương tớnh trờn 100.000 dõn là 88,7. Tỉ lệ này cao hơn 1,29 lần so với tỉ lệ phỏt hiện trờn toàn quốc cựng thời điểm (Số liệu của Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Hưng Yờn).
3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 3.1. Đối tượng nghiờn cứu
Toàn bộ bệnh nhõn lao mới cỏc thể <15 được chẩn đoỏn tại cỏc bệnh viện lao của 4 tỉnh (Hải Dương, Hưng Yờn, Thỏi Bỡnh, Vĩnh Phỳc) thuộc khu vực đồng bằng bắc bộ trong giai đoạn từ 1/2006 đến 12/2007.
Tiờu chuẩn chẩn đoỏn và chọn lọc bệnh nhõn:
- Bệnh nhõn <15 tuổi mắc lao mới được chẩn đoỏn theo tiờu chuẩn quy định bởi Chương trỡnh Chống lao Quốc gia (dựa trờn bảng điểm phõn loại trẻ em nghi ngờ mắc lao) và điều trị tại cỏc bệnh viện thuộc khu vực nghiờn cứu trong giai đoạn 2006-2007.
- Sàng lọc cỏc trường hợp cú đặc điểm dịch tễ và lõm sàng nghi lao trẻ em (xếp theo thứ tựưu tiờn) theo:
• Tiền sử tiếp xỳc với người lớn mắc lao AFB dương tớnh
• Hỡnh ảnh X-quang phổi bất thường: cú hạch trung thất to, hỡnh mờ thõm nhiễm ở phổi
• Kết quả thử nghiệm mantoux dương tớnh
Địa điểm nghiờn cứu:
- Hà Nội (Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trung ương) - Vĩnh Phỳc (Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trung ương) - Hải Dương (Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Hải Dương) - Hưng Yờn (Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Hưng Yờn) - Thỏi Bỡnh (Bệnh viện Lao và Bệnh phổi)
3.2. Vật liệu nghiờn cứu
- Hồ sơ, bệnh ỏn bệnh nhi mắc lao<15 tuổi chẩn đoỏn và điều trị tại cỏc bệnh viện và cơ sở y tế trực thuộc tinh thuộc cỏc địa điểm nghiờn cứu nờu trờn.
- Bệnh phẩm gồm đờm, dịch dạ dày, cỏc thể dịch tiết khỏc như dịch nóo tuỷ, dịch rửa phế quản, nước tiểu, v.v được thu thập từ cỏc bệnh nhi phục vụ xột nghiệm chẩn đoỏn bệnh lao
- Chủng M. tuberculosis chuẩn (do Viện Pasteur Paris cấp) và cỏc chủng M. tuberculosis phõn lập được từ bệnh nhi trong nghiờn cứu - Sinh phẩm và hoỏ chất cơ bản: mụi trường: Loweintain-Jensen, thuốc
chống lao: rifampicin, isoniazid, ethambutol, streptomycin; hỗn dịch mix sử dụng mồi đặc hiệu cho nhúm chủng M. tuberculosis phục vụ cho kỹ thuật spoligotyping:
Dra: 5’biotin GGT TTT GGG TCT GAC GAC 3’ Drb: 5’ CCG AGA GGG GAC GGA AAC 3’
- Kớt màng lai spoligo (Isogen Biosciene); cộng hợp gắn streptavidin (Roche); SDS (Sigma).
- Thiết bị và vật liệu sử dụng trong phõn tớch spoligotyping và RFLP: Mỏy khuếch đại nhiệt PCR, lũ lai, tủ ấm, mỏy lắc, miniblotter, màng nitrocelluler gắn với 43 trỡnh tự spolionucleotid trung gian của DNA
M. tuberculosis.
3.3. Phương phỏp nghiờn cứu
3.3.1. Đỏnh giỏ tỡnh hỡnh mắc lao của trẻ em <15 tuổi
Đỏnh giỏ tỡnh hỡnh mắc lao của trẻ em <15 tuổi thuộc 4 tỉnh đồng bằng Bắc bộ: Nghiờn cứu đỏnh giỏ tỡnh hỡnh mắc lao của trẻ <15 tuổi nhập viện từ thỏng 1/2006 đến thỏng 12/2007 tại cỏc địa điểm nghiờn cứu nờu trờn thụng qua danh sỏch bệnh nhõn và hồ sơ bệnh ỏn do cỏc bệnh viện và trung tõm bệnh xó hội tỉnh cung cấp.
Cỏc chỉ số cần đạt được:
- Tỉ lệ lao trẻ em so với tổng số mắc lao của toàn tỉnh;
- Cỏc thể lao, triệu chứng lõm sàng thường gặp và một số thụng số dịch tễ học liờn quan.
3.3.2. Xỏc định tỉ lệ nuụi cấy dương tớnh với M. tuberculosis của bệnh phẩm thu thập từ bệnh nhi <15 tuổi thuộc cỏc địa điểm nghiờn cứu phẩm thu thập từ bệnh nhi <15 tuổi thuộc cỏc địa điểm nghiờn cứu
Bệnh phẩm cỏc thể loại được thu thập từ bệnh nhi <15 tuổi cú chẩn đoỏn mắc lao trong năm 2007 tại cỏc cơ sở lõm sàng thuộc 4 tỉnh - địa điểm nghiờn cứu. Sau khi lấy mẫu, bệnh phẩm được đưa về Khoa Vi sinh, Viện Lao và Bệnh phổi Trung ương làm cỏc xột nghiệm vi sinh học như soi kớnh tỡm trực khuẩn khỏng cồn, khỏng axit (AFB), nuụi cấy phõn lập chủng M. tuberculosis và xỏc định tớnh nhạy cảm với cỏc thuốc chống lao của vi khuẩn.
Nuụi cấy và xỏc định tớnh nhạy cảm thuốc chống lao của chủng M. tuberculosisđược thực hiện theo cỏc quy trỡnh xử lý mẫu, nuụi cấy phõn lập trờn mụi trường Loweinstain-Jensen, phương phỏp tỉ lệ xỏc định tớnh nhạy cảm với thuốc chống lao do TCYTTG và Chương trỡnh Chống lao Quốc gia quy định.
Cỏc chỉ số cần đạt được:
- Xỏc định tỉ lệ soi kớnh tỡm trực khuẩn khỏng cồn, khỏng axit (AFB) và tỉ lệ nuụi cấy dương tớnh với M. tuberculosis
- Xỏc định tớnh khỏng thuốc của chủng M. tuberculosis thu thập được bằng phương phỏp tỉ lệ.
3.3.3. Nghiờn cứu một số đặc điểm sinh học phõn tử của chủng M.
tuberculosis phõn lập từ bệnh nhõn lao <15 tuổi:
Đặc điểm chất sinh học phõn tử của cỏc chủng M. tuberculosis phõn lập được từ bệnh nhi mắc lao <15 tuổi được xỏc định bằng phương phỏp định typ spoligonucleotid (spoligotyping) và phương phỏp đa dạng cỏc trỡnh tự cắt