2. TỔNG QUAN
3.3.3. Nghiờn cứu một số đặc điểm sinh học phõn tử của chủng M tuberculosis
tuberculosis phõn lập từ bệnh nhõn lao <15 tuổi:
Đặc điểm chất sinh học phõn tử của cỏc chủng M. tuberculosis phõn lập được từ bệnh nhi mắc lao <15 tuổi được xỏc định bằng phương phỏp định typ spoligonucleotid (spoligotyping) và phương phỏp đa dạng cỏc trỡnh tự cắt đoạn giới hạn (RFLP).
a) Phương phỏp spoligotyping:
+ Nguyờn tắc: Dựa trờn tớnh đa dạng DNA tại vựng lặp lại trực tiếp (direct repeat-DR) trờn nhiễm sắc thể của vi khuẩn thuộc nhúm M. tuberculosis.
Vựng DR chứa cỏc trỡnh tự cú độ dài 36 bp, xen kẽ bởi cỏc đoạn khụng lặp lại cú độ dài 35-41 bp. Số lượng bản sao trỡnh tự DR ở M. bovis BCG là 49, ở cỏc chủng khỏc thuộc nhúm M. tuberculosis, số lượng này dao động đỏng kể, do vậy là một trong cỏc dấu ấn di truyền được sử dụng nhiều trong phõn loại chủng ở mức độ phõn tửđang được sử dụng hiện nay. Phương phỏp bao gồm hai bước cơ bản: khuếch đại đoạn DNA thuộc vựng DR của vi khuẩn và lai ghộp sản phẩm khuếch đại này với cỏc spoligonucleotid gắn trờn màng nitrocelluler để phỏt hiện trờn phim õm bản.
+ Khuếch đại DNA thuộc vựng DR của M. tuberculosis bằng PCR:
- Chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn: vi khuẩn M. tuberculosis mọc trờn mụi trường nuụi cấy được thu hoạch, pha trong hỗn dịch TE (TrisHCl 10mM, EDTA 1mM) và đun sụi ở nhiệt độ 1000C trong 10 phỳt để bất hoạt vi khuẩn và giải phúng DNA.
- Chu trỡnh phản ứng PCR: 96oC trong 3 phỳt, sao đú là 30 chu kỳ tổng hợp và khuếch đại DNA, mỗi chu kỳ gồm giai đoạn biến tớnh: 960C trong 60 giõy; giai đoạn gắn mồi: 550C trong 60 giõy; và giai đoạn tổng hợp kộo dài: 720C trong 30 giõy.
+ Lai sản phẩm PCR với oligonucleotid:
- Chuẩn bị màng nitrocelluler cho lai ghộp sản phẩm PCR:
1) Rửa màng lai trong 250 ml dung dịch 2xSSPE /0,1% SDS ở 60oC trong 5 phỳt (hai lần).
2) Đặt màng lai vào trong miniblotter, cốđịnh miniblotter
3) Cho 20 àl sản phẩm PCR lờn màng lai, theo từng rónh của miniblotter (hoà trong 150 àl dung dịch đệm 2xSSPE/ 0,1%SDS). Ủ màng lai ở 60oC trong 1 giờ
Bao gồm cả chứng õm (dung dịch TE) và chứng dương (DNA của chủng chuẩn H37Rv và M. bovis BCG).
4) Hỳt bỏ hoàn toàn dung dịch trong cỏc khe bằng bơm hỳt chõn khụng, lấy màng lai và rửa màng lai 2 lần trong 250 ml 2xSSPE/ 0,5%SDS ở 60oC trong 10 phỳt trờn mỏy lắc ngang 5) Ủ màng lai với cộng hợp streptavidin-peroxidaza (pha loóng
1/4000 trong 2xSSPE/0,5%SDS) trong lũ lai ở 42oC trong 90 phỳt.
6) Lặp lại bước rửa: 2 lần trong 250 ml 2xSSPE/0,5%SDS tại 42oC trong 10 phỳt và 2 lần trong 250 ml dung dịch 2xSSPE trong 5 phỳt tại nhiệt độ phũng.
7) Ủ màng lai trong 40 ml dung dịch phỏt hiện E.C.L trong 2 phỳt 8) Chuyển sản phẩm lai sang phim E.C.L (Hyperfilm-ECL,
Amersham) trong hộp cỏt xột trong 15 phỳt.
9) Rửa phim và đọc kết quả. Cỏc đoạn DNA trung gian đặc hiệu cú trờn genome của vi khuẩn lao xuất hiện trờn phim tạo thành spoligotype cho mỗi chủng vi khuẩn.
Mỗi chủng vi khuẩn lao riờng biệt sẽ cú một kiểu hỡnh vạch spoligonucleotid đặc trưng. Kết quả xỏc định kiểu hỡnh spoligonucleotid của chủng nghiờn cứu được đưa vào phần mềm spolDB4 đểđối chiếu với cỏc kiểu hỡnh vạch của cỏc chủng lao chuẩn và với cỏc chủng đó được cụng bố trong cơ sở dữ liệu spoligotyping quốc tế, spolDB4, website:
www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVITDemo/. Từ đú nguồn gốc,
xuất xứ, số hiệu quốc tế và kiểu hỡnh spoligonucleotid dạng số húa của từng chủng nghiờn cứu cú thểđược xỏc định.
b. Phương phỏp RFLP được sử dụng để nghiờn cứu tớnh chất đa dạng phõn tử thụng qua cỏc dấu ấn di truyền IS6110 và cỏc trỡnh tự lặp lại trực tiếp (Direct repeat-DR) trờn DNA của chủng.
- Tỏch DNA genome toàn phần của vi khuẩn M. tuberculosis bằng chloroform
- Cắt DNA bằng enzyme giới hạn PVUII (Boehringer Mannheim) (enzym endonucleaza chỉ cắt IS6110, trỡnh tự đặc trưng của vi khuẩn nhúm M.
tuberculosis): PvuII cắt cỏc trỡnh tự CAG /CTG; GTC/GAC. - Tỏch cỏc đoạn DNA đa được cắt giới hạn bằng điện di trờn gel agarose:
nhỏ hỗn dịch mẫu với nồng độ tương đương 1ug DNA vào mỗi giếng của gel agarose 1% cú kớch thước 16x20 cm ; chạy điện di với cường độđiện trường 3.2 V/cm (100V) trong 10 phỳt, sau đú giảm xuống đến 0.8V/cm (25V) và chạy qua đờm.
- Southern blotting (kỹ thuật chuyền cỏc đoạn DNA từ gel sang màng nitrocelluler Hybond N-plus để thực hiện cỏc kỹ thuật lai dễ dàng hơn): với nguyờn tắc chuyển bằng lực hỳt mao dẫn, cỏc đoạn DNA ngắn khoảng 1kb được dịch chuyển từ gel agarose sang bề mặt của màng nitrocelluler qua dũng chất lỏng chảy nhờ lực hỳt mao dẫn.
- Lai và phõn tớch kết quả: lai và phỏt hiện sản phẩm bằng hệ thống ECLTM Direct System, sử dụng mẫu dũ DNA tinh sạch đặc hiệu với IS6110 (tương ứng 245bp) gắn peroxidaza và phỏt hiện bằng phản ứng với cơ chất hiện mầu. Sau khi gắn với peroxidaza, đầu dũ được lai với cỏc đoạn DNA gắn trờn màng Nitrocelluler Hypond N+; peroxidaza ụxy hoỏ cơ chất luminol, phản ứng phỏt quang và được ghi lại trờn phim õm bản để phỏt hiện bằng hệ thống ECL (Amersham ELCTM Direct System RPN 3001).
- Đọc kết quả bằng phần mềm phõn tớch dựa trờn cỏc mẫu M. tuberculosis
chuẩn được phõn tớch cựng thời điểm. - Quản lý số liệu bằng phần mềm SPSS