Có thể chuẩn bị mơi trường tự nhiên hoặc mơi trường nhân tạo:
* Môi trường tự nhiên: là môi trường nước quả dùng để lên men, đây là môi trường thuận lợi và dễ chuẩn bị, có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết. Nấm men được nhân giống trong môi trường này sẽ có ưu điểm là chúng quen dần với môi trường lên men, nên khi bổ sung vào dịch lên men chúng phát triền mạnh mẽ ngay từ đầu rất thuận lợi cho quá trình lên men mạnh. Nếu dùng nước quả phải tiến hành điều chỉnh thành phần đường sao cho đạt 10–12%, ngoài ra cần thiết phải cho thêm các chất như: thêm 0,3-0,5g/l amonsunphat hay amoncacbonat và 0,5 - 1mg B1/l.
* Môi trường nhân tạo: Là môi trường tự pha chế với các thành phần chính
như sau:
Nước cất : 1000 ml.
Đường kính : 10 – 12 %.
Acid citric : 6 gam.
Hỗn hợp muối khoáng : 3gam (Kali phosphat 2 gam, Amonsunphat 1gam ).
Vitamin B1; B6; PP; B3 : mỗi thứ từ 0,2–1 mg..
Biotin : 20-100 mg.
Mesoinoziton : 5- 10 mg.
Hình 2.4: Sơ đồ chuẩn bị mơi trường ni cấy nấm men Lê Lê Rửa sạch, gọt vỏ, bỏ hạt và lõi. Ép. Dịch quả. Thanh trùng (60-700C, 3-5 phút)
Môi trường nuôi nấm men. B1: 0,5 – 1 mg. 0,3-0,5 g /l amonsunphat Điều chỉnh pH = 4,5; [Đường]=12-140Bx. Acid citric
II.5.2.2. Thao tác cấy nấm men và điều kiện nuôi cấy, xác định số lượng tế bào nấm men
Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ni tăng sinh khối nấm men
Mơi trường đã chuẩn bị được chuyển vào bình tam giác 1000ml. Tiến hành cấy nấm men của 2-3 ống giống vào môi trường này. Tiến hành nhân giống trong điều kiện:
Nhiệt độ nuôi cấy là 250C.
Thời gian nhân giống khảo sát từ 4 – 36 giờ. Chọn thời gian thích hợp nhất để ni tăng sinh nấm men: khi nấm men đạt số lượng cao nhất và ở trạng thái cân bằng
thì dừng.
Kết quả thu được. Oxy vô
trùng
Cấy nấm men vào môi trường nuôi tăng sinh.
Nuôi trong điều kiện:
+ Nhiệt độ thường (250C) + Có sục khí đã qua khử trùng.
Định kỳ kiểm tra số lượng nấm men với tần suất 4h/lần.
Có sục khí oxy vơ trùng bằng cách sử dụng khí đã được sục qua dung dịch thuốc tím.
Hình 2.6: Mơ hình sục khí ni tăng sinh nấm men
Trong q trình ni, ta phải định kì kiểm tra số lượng nấm men tăng sinh được với tần suất 4h/lần. Thao tác kiểm tra như sau: hút 5ml dịch nuôi cấy (chú ý hút ở đáy bình, vì ở đây lượng nấm men tập trung cao nhất), mang đi ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút. Gạn lọc phần nước ở trên và cho nước cất vào để tiếp tục ly tâm, ly tâm đến khi lớp nước ở trên trong là được. Lần gạn nước cuối cùng, ta bổ sung nước cất sao cho bằng với thể tích ban đầu hút đi ly tâm. Sau đó tiến hành đếm dưới kính hiển vi nhờ buồng đếm.
Quy tắc đếm trên buồng đếm như sau:
X X
X
X X
Hình 2.7: Cấu tạo của buồng đếm
Buồng đếm gồm 25 ô lớn bằng nhau như đã vẽ ở trên, trong mỗi ơ lớn có 16 ơ nhỏ. Khi đếm, ta tiến hành đếm 5 ô đã được đánh dấu , sau đó lấy giá trị trung bình. Nếu số lượng nấm men quá nhiều, các tế bào nấm men nằm sát và chồng lên nhau, ta khơng đếm được thì tiến hành pha lỗng bậc 10 để đếm.
Kết quả sau khi đếm được tính như sau: ) / ( 1000 * * ml tb V F A X
Trong đó: X: Số tế bào nấm men trong 1ml dịch (tb/ml). F: Hệ số pha loãng.
V: Thể tích dịch hút đi ly tâm (ml).