CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.8. Phương pháp phân tích định lượng saponin (G-Rg1, M-R2, G-Rb1)
Củ của cây sâm Ngọc Linh 2 năm tuổi được thu nhận, rửa sạch, phơi khô và nghiền thành bột. Bột (0,5 g) được chiết hoàn toàn trong metanol bằng máy sonicator (10 mL metanol x 6 lần). Sau đó, dung dịch này được làm bay hơi bằng thiết bị bay hơi để làm khô cặn. Các chất cô đặc được hòa tan trong 20 mL nước và được phân đoạn bằng ethylic và n-butanol. N-butanol được cô trong áp suất chân không để thu được dịch chiết khô. Dịch chiết đã làm khơ được hịa tan bằng hỗn hợp dung môi nước axetonitril (2:1) và được lọc qua màng 0,45 mm. Dịch lọc cuối cùng được đưa vào hệ thống HPLC để xác định định lượng saponin bằng cách sử dụng phương pháp đường chuẩn. Hệ thống HPLC: Cột Supelco RP C18 (250 mm x 4,6 mm; I.D. 5 mm) và máy dò SPD-M20A-PDA (Shimadzu) đã được sử dụng. Thơng số HPLC: thể tích tiêm 20 mL; tốc độ dòng 0,5 mL/phút. Nhiệt độ cột được giữ ở 25°C [171].
ĐIỀU KIỆN NI CẤY
Điều kiện ni cấy in vitro: Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ phòng 25 ± 2oC, chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ 40 – 45 µmol.m-2.s-1 dưới ánh sáng đèn huỳnh quang, độ ẩm trung bình 55 – 60%.
Điều kiện nuôi cấy ex vitro: Các thí nghiệm được tiến hành trong nhiệt độ ban ngày 27 ± 2oC, nhiệt độ ban đêm 14 ± 2oC, độ ẩm 65 – 70%, ánh sáng được che phủ 50 – 90% tuỳ thuộc vào từng thí nghiệm, giá thể được sử dụng là Klasmann TS1 với pH khoảng 5,5 – 6,5.
ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
Thí nghiệm ni cấy in vitro được thực hiện tại phòng Sinh học Phân tử và Chọn
tạo giống cây trồng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên), số 116, đường Xô Viết Nghệ Tĩnh, phường 7, thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
Thí nghiệm ni cấy ex vitro được thực hiện tại công ty cổ phần Công nghệ Sinh học Thái Dương, lô C18, khu quy hoạch viện Nghiên cứu hạt nhân, đường Hùng Vương, phường 11, thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
Thí nghiệm đo ethylene được thực hiện tại Viện Cây ăn quả miền Nam, QL1A, xã Long Định, huyện Châu Thành, tỉnh Tiền Giang.
Thí nghiệm xác định hàm lượng Ag được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân, số 1, đường Nguyên Tử Lực, phường 8, thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
Thí nghiệm xác định mật độ tế bào được thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới,
số 9/621, Xa lộ Hà Nội, khu phố Linh Trung, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh. Thí nghiệm quan sát bề mặt mơ sẹo được thực hiện tại phịng hiển vi điện tử, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, số 1, đường Yersin, thành phố Hà Nội.
Thí nghiệm xác định hàm lượng saponin được thực hiện tại Trung tâm Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh, số 41, đường Đinh Tiên Hồng, phường Đa Kao, quận 1, thành phố Hồ Chí Minh.
Thời gian thực hiện thí nghiệm từ 11/2016 – 2/2021.
PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ THỐNG KÊ
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi được xử lý bằng phần mềm MicroSoft Excel® 2017 và phần mềm phân tích thống kê SPSS 16.0 theo phương pháp Duncan’s test với a = 0,05 [52].