CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.3. Một số hạn chế trong vi nhân giống thực vật
1.1.3.1. Tích luỹ khí ethylene Giới thiệu chung Giới thiệu chung
Khí ethylene được biết đến nhiều nhất trong vai trị làm chín hoa quả [45]. Ngồi ra, ethylene cịn là một loại hormone thực vật dạng khí có ảnh hưởng đến nhiều q trình sinh lý thực vật bao gồm: cảm ứng mô sẹo, phát sinh phôi, nuôi cấy huyền phù tế bào, tái sinh chồi, hình thành rễ, sự rụng lá, ra hoa, lão hố [92]. Q trình sinh tổng hợp ethylene được điều chỉnh chặt chẽ bởi các tín hiệu nội sinh và ngoại sinh (sự tấn công từ các mầm bệnh, tạo vết thương, thiếu oxy, ozone, làm lạnh hoặc đông lạnh) [92].
Con đường sinh tổng hợp khí ethylene trong thực vật
Thực vật tổng hợp ethylene theo con đường sinh hóa được mơ tả bởi Houben và Van de Poel (2019) [76]. Tiền thân của con đường sinh tổng hợp ethylene là amino acid methionine. Methionine được chuyển đổi thành SAM (S-adenosyl-L- methionine) nhờ enzyme ACS (ACC-Synthase) và cần năng lượng ATP (Adenozin triphotphat). SAM được chuyển đổi thành ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid) và MTA (methylthioadenosine) - sản phẩm phụ của phản ứng được dùng để tái sinh methionine theo chu kỳ Yang tránh sự cạn kiệt methionine trong quá trình sản
xuất nhiều ethylene bởi enzyme ACS. Sau đó, ACC được khuếch tán đến các cơ quan, bộ phận khác nhau trong cây, và được chuyển hóa thành ethylene nhờ enzyme ACO (ACC-oxidase) (Hình 1.1).
Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp khí ethylene trong thực vật
Con đường dẫn truyền tín hiệu ethylene trong thực vật
Con đường truyền tín hiệu ethylene trong thực vật được mô tả bởi Azhar và cộng sự (2019) [28]. Ethylene được nhận dạng bởi một nhóm 5 thụ thể trong màng tương đồng với histidine kinase của vi khuẩn liên quan đến việc nhận biết những thay đổi môi trường. ETR1 (ethylene response1) và ERS1 (ethylene response sensor1) chứa ba miền xuyên màng và một miền histidine kinase đã được chứng minh là hoạt động như các homodimers. ETR2 (ethylene response2), EIN4 (ethylene insensitive4) và ERS2 (ethylene response sensor2) có bốn vùng xuyên màng và miền histidine kinase đã bị thối hóa. Chỉ ETR1, ETR2 và EIN4 có miền nhận tại C-terminal. Liên kết ethylene xảy ra tại miền xuyên màng N-terminal của các thụ thể, và một ion đồng (Cu) là cần thiết cho liên kết. Trong trường hợp khơng có tín hiệu ethylene, các CTR1 (constitutive triple response1) liên kết với các thụ thể và EIN2 (ethylene insensitive2), dẫn đến khơng kích hoạt được phản ứng ethylene. Trong trường hợp có ethylene liên kết với các thụ thể làm việc vơ hiệu hóa CTR1, cho phép EIN2 hoạt động như một bộ điều chỉnh tích cực của con đường sinh ethylene. EIN2 chứa N-terminal tương tự như protein vận chuyển kim loại Nramp và C-terminal. EIN2 truyền tín hiệu tích cực xuống EIN3 (ethylene insensitive3) là các yếu tố phiên mã nằm trong nhân. EIN3
liên kết với gen khởi động ERF1 (ethylene response factor1) và kích hoạt q trình phiên mã theo cách phụ thuộc ethylene. Các yếu tố phiên mã ERF1 và các EREBP (ethylene responsive element binding protein) khác có thể tương tác với các gene khởi động mục tiêu và kích hoạt phản ứng ethylene tiếp theo (Hình 1.2).
Hình 1.2. Con đường truyền tín hiệu ethylene trong thực vật
1.1.3.2. Hoá nâu mẫu cấy
Một số thực vật vi nhân giống cũng thường xuất hiện hiện tượng hóa nâu mẫu cấy cũng như hóa nâu mơi trường ni cấy. Đơi khi tình trạng hóa nâu trở nên nghiêm trọng đến mức mẫu cấy chuyển màu nâu sẫm/đen, hoại tử và cuối cùng chết. Các nhà khoa học cho rằng sự sản sinh phenol trong suốt q trình ni cấy gây oxy hóa và làm cho mẫu, mơi trường hóa nâu. Các sản phẩm oxy hóa của phenol có thể là độc tố thực vật. Mức độ hóa nâu phụ thuộc vào lồi thực vật ni cấy, kiểu gene, độ tuổi của mô cấy (mô già hơn cho thấy khả năng bị hóa nâu cao hơn), mùa ni cấy (nhiều hơn vào mùa đông và mùa thu) và thành phần của môi trường. Một phương pháp đơn giản để bảo vệ các mẫu cấy khỏi sự hóa nâu là cấy chuyền thường xuyên ở giai đoạn ni cấy ban đầu; giảm sự oxy hóa phenol bằng phương pháp ni cấy trong tối; giảm nồng độ muối của môi trường; bổ sung các chất bổ trợ như acid ascorbic, cystein-
hấp thụ phenol [164], do đó kiểm sốt được tình trạng hóa nâu; acid ascorbic chỉ có hiệu quả nếu nó được thêm vào bề mặt mơi trường và khơng có hiệu quả nếu đưa vào mơi trường trước khi hấp. Tuy nhiên, các chất hấp phụ này có thể hấp thu ln cả các hợp chất cần thiết cho thực vật từ mơi trường, do đó việc sử dụng loại và nồng độ của chúng nên được lựa chọn một cách thận trọng [40].
NANO KIM LOẠI 1.2.1. Giới thiệu chung
Vật liệu nano được phát hiện và công nhận vào những năm đầu thập niên 50 của thế kỷ XIX, có kích thước nằm trong phạm vi từ 1 – 100 nm [60]. Dựa trên nguồn gốc có thể chia các hạt nano thành 3 loại là nano tự nhiên, nano ngẫu nhiên và nano nhân tạo. Các nano tự nhiên tồn tại kể từ khi trái đất hình thành, những hạt này có trong bụi đất, bụi mặt trăng, các khống vật, phản ứng quang hóa, cháy rừng và xói mịn. Nano ngẫu nhiên được tạo ra bởi quy trình cơng nghiệp nhân tạo như xả xăng/dầu diesel, đốt than, khói hàn và xả thải cơng nghiệp. Các nano nhân tạo có thể được chia thành 5 loại: nano carbon, nano kim loại, nano từ, nano dendrimers. Trong đó, nano kim loại được nghiên cứu sản xuất và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: y học, môi trường, năng lượng, điện tử, khoa học đời sống bao gồm cả khoa học cây trồng [113], [110]. Nano kim loại là các hạt nano có cấu trúc nano core-shell. Phần lõi (core) là các ngun tử kim loại hóa trị khơng (như kim loại Au, Ag, Cu, Fe, Ni, Mo, Zn,...). Phần vỏ phủ (shell) có thể là các chitosan, lớp mỏng nano (nano silica, nano vàng,...), các oxide/hydroxide kim loại, carboxymethyl cellulose, glycerin, citrate, citric, polyvinylalcol, polyethylene glycol, polyvinylpyrolidone. Tùy vào phương pháp tổng hợp và đối tượng áp dụng mà có thể sử dụng các chất ổn định và vùng lõi phù hợp, giúp các hạt nano được phân tán trong mơi trường đạt hiệu quả cao [121]. Do kích thước hạt nano kim loại vô cùng nhỏ (<100 nm) nên số nguyên tử nằm trên bề mặt của vật liệu nano cao hơn rất nhiều so với các vật liệu khối và mỗi nguyên tử được tự do tương tác với mơi trường xung quanh đóng vai trị như các tâm hoạt động, chính vì vậy các vật liệu nano thường có hoạt tính hóa học cao [71].
Trong lĩnh vực khoa học cây trồng, vật liệu nano đã và đang là một công cụ đầy hứa hẹn thúc đẩy một kỷ nguyên mới của các phương thức canh tác cây trồng
chính xác và hiệu quả để giải quyết nhu cầu sản lượng lương thực ngày càng cao trên thế giới [42], [87].
1.2.2. Ứng dụng nano kim loại trong vi nhân giống thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phương pháp cốt lõi của ngành cơng nghệ sinh học thực vật; có vai trị quan trọng đối với việc bảo tồn, nhân giống hàng loạt, kỹ thuật di truyền, sản xuất các hợp chất thứ cấp. Trong những năm gần đây việc ứng dụng các hạt nano đã thành công trong việc loại bỏ nấm và vi sinh vật trong khử trùng bề mặt mẫu cấy, bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm kiểm soát nhiễm nấm và vi khuẩn, phát sinh hình thái, tạo cây hồn chỉnh đã được báo cáo thông qua Bảng 1.5 và Bảng 1.6.
Bảng 1.5. Một số nghiên cứu và ứng dụng nano kim loại trên thế giới
Nội dung Nano Loài thực vật Nguồn
Khử trùng bề mặt 100 mg/L AgNPs
trong 180 phút Valeriana officinalis [22] 200 mg/L AgNPs
trong 15 phút Gerbera jamesonii [58] 200 mg/L AgNPs
trong 20 phút
Fragaria × ananassa [161]
100 mg/L AgNPs
trong 1 hoặc 5 phút Arabidopsis thaliana, Lycopersicon esculentum, Solanum tuberosum
[102]
200 mg/L AgNPs
trong 180 phút Araucaria excelsa [138] 500 mg/L AgNPs Kappaphycus striatus [107] 100 mg/L AgNPs trong 7 phút Gốc ghép (Prunus amygdalus × Prunus persica) [27]
Bổ sung vào mơi trường ni cấy nhằm kiểm sốt nhiễm nấm và vi khuẩn
400 mg/L AgNPs Olea europaea [132]
1% TiO2NPs Solanum tuberosum [134] 60 mg/L TiO2NPs Hordeum vulgare [103] 100 mg/L
ZnNPs or ZnONPs
150 mg/L AgNPs Gốc ghép (Prunus
amygdalus × Prunus persica)
[27]
Khử trùng môi
trường nuôi cấy 4 mg/L AgNPs Chrysanthemum spp. [158] Bổ sung vào mơi
trường vi thuỷ canh nhằm kiểm sốt nhiễm nấm và vi khuẩn
7,5 mg/L AgNPs Chrysanthemum spp. [159]
Tái sinh chồi 25 hoặc 50 mg/L
AgNPs Vanilla planifolia [149]
Nhân nhanh chồi 2,0 mg/L AgNPs Rosa hybrida L. [68] Cảm ứng mô sẹo,
tái sinh cây 15 mg/L ZnONPs Solanum lycopersicum [24] Cảm ứng mô sẹo 8 mg/L AgNPs Solanum nigrum [57] 25 – 500 mg/L CNPs Satureja khuzestanica [64] Tạo cây hoàn chỉnh 50 mg/L AgNPs Brassica juncea [142]
1 – 20 mg/L ZnONPs
Brassica nigra [170]
10 mg/L AuNPs Arabidopsis thaliana [91] 4,65 µg/L CoNPs Rosa hybrida L. [68] 0,75 mM FeNPs Dianthus caryophyllus [115] 5 mg/L CuSO4NPs Verbena bipinnatifida [63]
Bảng 1.6. Một số nghiên cứu và ứng dụng nano kim loại ở Việt Nam
Nội dung Nano Loài thực vật Nguồn
Khử trùng bề mặt mẫu cấy 0,5 g/L AgNPs trong 15 phút Saintpaulia ionantha [12] 0,1 g/L AgNPs trong 15 phút
Passiflora edulis Sims. Passiflora edulis f. flavicarpa [3] Khử trùng môi trường nuôi cấy 4 mg/L AgNPs Chrysanthemum spp. [14]
Tăng trưởng và kháng
vi sinh vật 7,5 mg/L AgNPs Chrysanthemum spp. [18] Sinh trưởng, phát triển
trong môi trường rắn 1,5 mg/L AgNPs Chrysanthemum spp. [97] Sinh trưởng, phát triển
trong môi trường lỏng
1,5 mg/L AgNPs Chrysanthemum spp. [97] Sinh trưởng, phát triển
trong môi trường thuỷ canh
5 mg/L AgNPs Chrysanthemum spp. [97]
Sinh trưởng, phát triển
trong môi trường rắn 75 mM FeNPs Chrysanthemum morifolium Ramat. cv.
"Jimba"
[160]
Sinh trưởng, phát triển trong môi trường vi thuỷ canh in vitro
100 mM FeNPs Chrysanthemum morifolium Ramat. cv.
"Jimba"
[160]
Sinh trưởng, phát triển trong môi trường vi thuỷ canh
75 mM FeNPs Chrysanthemum morifolium Ramat. cv.
"Jimba"
[160]
Sinh trưởng của rễ tơ 1,5 mg/L CuNPs Panax vietnamensis Ha
et Grushv. [6]
Nhân nhanh chồi 2 mg/L AgNPs Rosa hybrida [8]
2 mg/L AgNPs Gerbera jamesonii [9] Tạo cây hoàn chỉnh 5 mg/L AgNPs Gerbera jamesonii [9] 10 mg/L AgNPs Chrysanthemum spp. [13] 10 mg/L AgNPs Fragaria spp. [13] 5 mg/L AgNPs Gerbera jamesonii [13] 3 mg/L AgNPs Gerbera jamesonii [8] 10 mg/L FeNPs Chrysanthemum spp. [16]
1.2.3. AgNPs và FeNPs trong vi nhân giống thực vật
1.2.3.1. AgNPs trong vi nhân giống thực vật
Cơ chế tác dụng của bạc trong vi nhân giống
Một đặc tính phổ biến của bạc (Ag) đã được biết trên toàn thế giới trong nhiều thế kỷ qua đó là tính kháng vi sinh vật. Từ xa xưa, người ta sử dụng đặc tính này của
dấm; ở thế kỷ XX, người ta thường đặt một đồng Ag trong chai sữa để kéo dài độ tươi của sữa; chúng còn được dùng rộng rãi trong điều trị các vết bỏng và khử trùng vết thương. Sau khi thuốc kháng sinh được phát minh và đưa vào ứng dụng với hiệu quả cao, người ta khơng cịn quan tâm đến tác dụng kháng khuẩn của Ag nữa. Tuy nhiên, từ những năm gần đây do hiện tượng các chủng vi sinh ngày càng trở nên kháng thuốc kháng sinh, con người bắt đầu quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng kim loại Ag vào khả năng diệt khuẩn hay các ứng dụng khác; đặc biệt dưới dạng Ag có kích thước hạt nano [143]. Các đặc tính kháng khuẩn của Ag bắt nguồn từ tính chất hố học của các ion Ag+. Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglycan - thành phần cấu tạo nên thành tế bào của vi khuẩn - ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Nếu các ion Ag được lấy ra khỏi tế bào thì khả năng hoạt động của vi khuẩn lại được phục hồi. Khác với vi sinh vật, động vật khơng có thành tế bào, nên ion Ag+ khơng thể gây tổn thương cho con người hay động vật [143]. Sau khi Ag+ tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh, nó sẽ đi vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm sulfhydryl-SH của phân tử enzyme chuyển hố oxy và vơ hiệu hố enzyme này dẫn đến ức chế q trình hơ hấp của tế bào vi khuẩn. Các ion Ag+ cịn có khả năng liên kết với các base của DNA và trung hồ điện tích của gốc phosphate do đó ngăn chặn q trình sao chép DNA [143]. Ngồi ra Ag+ cịn có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung mơi khác nhau, độ bền hố học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng hay các tác nhân oxy hố khử thơng thường, ổn định ở nhiệt độ cao và chi phí cho q trình sản suất thấp [81]. Do vậy, các ion Ag+ trước nay được biết đến như một loại ion khống có khả năng kháng khuẩn cao, ổn định và an tồn trong q trình sử dụng.
Mặt khác, Bạc (Ag) là một kim loại không được bổ sung thường qui vào môi trường nuôi cấy, mà chỉ được thêm vào môi trường nuôi cấy để điều tiết sự phát sinh hình thái, tăng trưởng và phát triển của cây trồng dưới dạng ion Ag+ trong muối nitrat bạc (AgNO3) và sulfate bạc (AgSO4) thơng qua ức chế sinh tổng hợp của khí ethylene. Một mặt, Ag có thể ngăn ngừa sự tổng hợp ethylene và làm đảo lộn vùng bám dính của ethylene. Thụ thể ETR1 có thể liên kết với ethylene thơng qua một trung tâm hoạt động là tiểu phần có 1 ion đồng (Cu+). Sự thay thế Cu+ bằng Ag+ khiến cho thụ thể
không thể liên kết với ethylene và ngăn ngừa các tín hiệu ức chế của ethylene lên thực vật. Điều này có thể là do sự giống nhau về kích thước, cùng trạng thái oxy hóa của cả ion Cu+ và ion Ag+ trong việc tạo thành phức chất với ethylene [176]. Mặt khác trong thực vật, polyamin đóng một số vai trị quan trọng như phân chia tế bào, phát sinh hình thái, sinh tổng hợp protein, nhân đơi DNA và giúp cây đáp ứng lại các tác nhân stress sinh học. Các nghiên cứu đã cho thấy mối tương quan chặt chẽ giữa ethylene, các polyamine và SAM. Trong mối tương quan này, cả ethylene và các polyamine điều có chung tiền chất là SAM cho sự sinh tổng hợp của chúng, do đó, việc sử dụng những chất ức chế sinh tổng hợp ethylene như AgNO3 sẽ khiến cho SAM không đi theo con đường sinh tổng hợp ethylene, cũng đồng nghĩa với việc SAM được chuyển hóa thành các polyamine nhiều hơn và tiến trình phát sinh hình thái được kích hoạt [92].
Ứng dụng AgNPs trong vi nhân giống
Với kích thước nhỏ hơn 20 nm, AgNPs sẽ có diện tích bề mặt lớn giúp tăng khả năng tiếp xúc với khơng gian bên ngồi, sự bám dính lên bề mặt tế bào gia tăng dẫn đến hiệu quả tác động và hoạt tính của AgNPs cao hơn so với ion Ag+ [169]. Theo tính tốn lý thuyết AgNPs có hoạt tính mạnh hơn ít nhất 40 lần trên mỗi đơn vị bạc so những dung dịch keo bạc thơng thường. Vì vậy, các nhà khoa học có thể sử dụng ít bạc hơn để đạt được hiệu quả tương đương. AgNPs ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng bằng cách gây ra những biến đổi đáng kể ở mức độ sinh lý và phân tử theo hướng tích cực hoặc tiêu cực tùy theo lồi thực vật, kích thước, cấu trúc và nồng độ AgNPs sử dụng. AgNPs không những có hiệu quả cao trong việc kháng vi sinh vật mà còn được biết đến với những tác động tích cực lên sự phát sinh hình thái, sinh trưởng và phát triển của cây vi nhân giống [33], [137]. Một số nghiên cứu đã cho thấy, AgNPs có khả năng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của nhiều loài thực vật bằng cách tăng cường các quá trình biến dưỡng trong cây như sinh tổng hợp chlorophyll, tổng hợp carbohydrate, protein và các enzyme chống oxy hóa [135], [142]. Ngoài tác dụng kháng vi sinh vật rất mạnh, dựa vào tính chất vật lý của hạt AgNPs hấp thu ánh sáng có bước sóng 390 – 420 nm, nên tại bước sóng này cường độ ánh sáng được thực vật hấp thu mạnh. Do đó, cây phát triển trên mơi trường có bổ
sung AgNPs thường tươi hơn, cao hơn, sinh trưởng tốt hơn, giảm hiện tượng rụng lá gây ra bởi ethylene, duy trì được màu xanh lá cây đậm hơn do tích lũy chlorophyll mạnh hơn so với cây trên môi trường không bổ sung [135]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được tác dụng của ion bạc là chất ức chế sinh tổng hợp khí ethylene trong