PCR là công cụ giúp phát hiện nhanh và chính xác mầm bệnh vi sinh vật trên tôm, cá. Với phương pháp PCR chỉ cần khoảng 1 ngày đã nhanh chóng phát hiện A. hydrophila, mà kết quả lại chính xác, vì khi đúng là DNA của A. hydrophila mới bắt cặp với mồi đặc trưng và hiện vạch tại vị trí 209 bp. Cũng tương tự đề tài của Nguyễn Trúc Phương (2008) đã dùng phương pháp PCR
để xác định kết quảđịnh danh E. ictaluri, cho kết quả nhanh và chính xác. Đề
tài ứng dụng phương pháp PCR để phát hiện A. hydrophila nhằm kiểm tra tính chính xác của kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn A. hydrophila gây ra trên cá tra. Nghiên cứu được thực hiện phản ứng PCR bằng 2 cách chiết tách mẫu và lấy mẫu từ khuẩn lạc thuần.
Kết quả phản ứng PCR mẫu DNA chiết tách từ vi khuẩn nuôi trong môi trường NB sau 18-24 giờ, ở 28-30oC được trình bày ở (hình 4.5). Từ kết quảở
(hình 4.5) cho thấy cả 14 mẫu chiết tách và đối chứng dương đều hiện vạch tại vị trí 209 bp, đối chứng âm không hiện vạch. Theo kết quả nghiên cứu của Panangala et al., (2007) đã ứng dụng phương pháp multiplex-PCR để phát hiện đồng thời 3 loài vi khuẩn quan trọng (E. ictaluri, Flavobacterium columnare và A. hydrophila), cho kết quả phát hiện A. hydrophilaở (209 bp). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
Hình 4.5 Kết quảđiện di sản phẩm PCR các chủng A. hydrophila.
- Giếng M: thang đo DNA
- Giếng 1: đối chứng âm (nước cất) - Giếng 2: đối chứng dương.
- 7 giếng DNA được chiết tách từ NB (giếng 3-9).
+ Giếng 3: chủng CA (t); Giếng 4: chủng SD (t); Giếng 5: chủng CA (tt); Giếng 6: chủng TN (tt); Giếng 7: chủng TN (g); Giêng 8: chủng TN (t); Giếng 9: chủng SD (tt).
- 7 giếng DNA được chiết tách pha loãng vi khuẩn với nước muối sinh lý (giếng 10-16).
+ Giếng 10: chủng CA (t); Giếng 11: chủng SD (t); Giếng 12: chủng CA (t); Giếng 13: chủng TN (tt); Giếng 14: chủng TN (g); Giếng 15: chủng TN (t); Giếng 16: chủng SD (t).
Chứng tỏ có sự hiện diện của A. hydrophila và trên tất cả 14 mẫu không có sản phẩm phụ, tuy nhiên ở giếng số 7, 8, 12, 13 và số 14 mẫu hiện vạch chưa rõ như các giếng còn lại, có thể do hàm lượng DNA chiết tách không đủ. Nồng
độ của mẫu và đoạn mồi sử dụng cho phản ứng này là 20 ng/µl và 10 µM. Nếu
có điều kiện nên tiến hành thử giảm các thành phần hóa chất tham gia phản
ứng PCR, để có thể tiết kiệm chi phí mà vẫn mang lại kết quả tốt.
Kết quả PCR mẫu lấy trực tiếp từ khuẩn lạc của 7 chủng vi khuẩn, không qua bước chiết tách được trình bày ở (hình 4.6). Qua kết quảở (hình 4.6) cho thấy cả 7 mẫu đều không hiện vạch ở 209 bp, có thể do mẫu vi khuẩn không qua bước chiết tách DNA nên kết quảđiện di sản phẩm PCR không hiện vạch. 1 2 3 4 5 6 7 M
Hình 4.6 Kết quảđiện di sản phẩm PCR, không qua chiết tách DNA của chủng A. hydrophila. Giếng 1: chủng CA (t); Giếng 2: chủng SD (t); Giếng 3: chủng CA (tt); Giếng 4: chủng TN (tt); Giếng 5: chủng TN (g); Giêng 6: chủng TN (t); Giếng 7: chủng SD (tt). 4.4 Độ nhạy của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila.
Để xác định giới hạn thấp nhất hàm lượng DNA của vi khuẩn mà phương pháp PCR có thể phát hiện được. Xác định bởi sự pha loãng của acid nucleic
được làm tinh sạch. Kết quả PCR xác định độ nhạy của phương pháp được thể
hiện qua (hình 4.7).
Dựa vào kết quảở (hình 4.7) cho thấy chỉ có 3 mẫu cho kết quả là (10o, 10-1 và 10-2) đều hiện vạch ở 209 bp, 7 mẫu còn lại có thể do hàm lương DNA quá thấp không đủ cho phản ứng PCR, nên không hiện vạch sau khi điện di. Hàm
lượng DNA thấp nhất cho phản ứng PCR để có thể phát hiện A. hydrophila là (10-2 = 1 ng/µl). Hình 4.7 Kết quảđiện di sản phẩm PCR phát hiện A. hydrophila xác định độ nhạy của phương pháp. Giếng M: thang đo DNA. Giếng 1: đối chứng âm (mẫu nước). Giếng 2: hàm lượng DNA 10o ng/µl (10o = 100 ng/µl). Giếng 3: 10-1; Giếng 4: 10-2; Giếng 5: 10-3; Giếng 6: 10-4; Giếng 7: 10-5; Giếng 8: 10-6; Giếng 9: 10-7; Giếng 10: 10-8; Giếng 11: 10-9. 4.5 Tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila.
Tính đặc hiệu của phương pháp là với các hàm lượng của thành phần hóa chất tham gia phản ứng và đoạn mồi đặc trưng thì phương pháp PCR chỉ phát hiện
A. hydrophila, không cho kết quả dương tính với các loài vi khuẩn khác. Kết quả được thể hiện ở (hình 4.8). Ở nghiên cứu của Panangala et al., (2007) đã ghi nhận kết quả xác định tính đặc hiệu của phương pháp m-PCR, 10 chủng vi khuẩn phân lập trong 3 loài vi khuẩn (E. ictaluri, Flavobacterium columnare
và A. hydrophila) thử với 11 chủng gram âm khác và 2 chủng gram dương có mặt khắp nơi từ môi trường nuôi thủy sản.
Hình 4.8 cho thấy với hàm lượng các thành phần hóa chất tham gia và đoạn mồi của phản ứng PCR chỉ cho phép phát hiện DNA của A. hydrophila khi thử
với 5 loài vi khuẩn khác (Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, E. ictaluri,
Pseudomonas putida, Eschericchia coli). Kết quả chỉ có giếng 2 (đối chứng
dương) là mẫu có DNA của A. hydrophila hiện vạch ở 209 bp, còn 5 giếng thử
các chủng vi khuẩn khác không hiện vạch. Giếng 1 (đối chứng âm) không hiện vạch chứng tỏ kết quả chiết tách DNA không nhiễm tạp.
Hình 4.8 Kết quảđiện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu của phương pháp phát hiện A. hydrophila.
Giếng M: thang đo DNA
Giếng 1: đối chứng âm (nước cất)
Giếng 2: đối chứng dương (mẫu DAN của chủng A. hydrophila). Giếng 3: DNA của chủng Vibrio alginolyticus.
Giếng 4:DNA của E. ictaluri
Giếng 5: DNA của Eschericchia coli.
Giếng 6: DNA của Pseudomonas putida
Giếng 7: DNA của Vibrio harveyi.
Từ kết quả điện di sản phẩm PCR xác định độ nhạy và tính chuyên biệt của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila, cho phép phát hiện nhanh và sớm các mầm bệnh ở dạng tiềm ẩn. Nên có thể kịp thời xử lý ao nuôi hạn chế rũi ro xảy ra. Đây sẽ là hướng đi mới trong việc chẩn đoán bệnh xuất huyết do A. hydrophila gây ra trên cá tra nuôi. Tuy nhiên phương pháp PCR tốn kém và cần thiết phải có máy móc hiện đại hơn phương pháp sinh hóa truyền thống và kít API 20E.
Phương pháp m-PCR là phương pháp đầy hứa hẹn cho việc phát hiện nhanh, nhạy và phát hiện đồng thời 3 loài vi khuẩn (E. ictaluri, Flavobacterium columnare và A. hydrophila) gây bệnh trên cá (theo Panangala et al., 2007).
Chương 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận
Đã thực hiện thành công các phản ứng PCR.
1. Có 7 chủng A. hydrophilađược chiết tách acid nucleic (Bartie et al., 2006) bằng 2 cách: (1) chiết tách từ vi khuẩn được nuôi trong NB, (2) chiết tách bằng cách pha loãng vi khuẩn với nước muối sinh lý (0,85% NaCl). Khuếch
đại DNA (Panangala et al., 2007 có chỉnh sửa bởi Đặng Thị Hoàng Oanh và
ctv, 2008), kết quả PCR khẳng định 14 mẫu DNA (từ 2 cách chiết tách) của 7 chủng vi khuẩn đã được định danh là A. hydrophilađều hiện vạch ở 209 bp. Với các thành phần phản ứng PCR: 1X Buffer, 1,5 mM MgCl2, 200 µM dNTPs, 2,5U Taq DNA polymerase, 0,4 µM mồi AeroFd, 0,4 µM mồi AeroRs, 1 µl DNA khuôn, nước cất. Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng 95oC trong 4 phút; tiếp 30 chu kỳ 95oC trong 30 giây, 60oC trong 45 giây, 72oC trong 30 giây; cuối cùng 72oC trong 10 phút.
Kết quảđiện di sản phẩm PCR của 7 mẫu vi khuẩn trên, được lấy trực tiếp từ đĩa NA không hiện vạch. Do mẫu vi khuẩn không qua bước chiết tách DNA, nên kết quảđiện di sản phẩm PCR không hiện vạch.
2. PCR xác định độ nhạy của phương pháp, phản ứng PCR từ một chủng A. hydrophila pha loãng ra 10 mẫu với hàm lượng DNA giảm dần cho kết quả điện di có 3 mẫu (với hàm lượng DNA 100 ng/µl, 10 ng/µl và 1 ng/µl) hiện vạch ở (209 bp). Vậy hàm lượng DNA thấp nhất có thể phát hiện được là 1 ng/µl mẫu.
3. PCR xác định tính đặc hiệu của phương pháp thử phản ứng PCR chủng A. hydrophila với các chủng Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, E. ictaluri,
Pseudomonas putida, Eschericchia coli. Kết quả chỉ có mẫu DNA của A. hydrophila hiện vach ở vị trí 209 bp, còn lại các mẫu không hiện vạch. Vậy phương pháp PCR này với các thành phần hóa chất tham gia phản ứng và đoạn mồi đặc trưng chỉđể phát hiện DNA của A. hydrophila.
5.2 Đề xuất
- Nên ứng dụng phương pháp PCR để phát hiện sớm mầm bệnh A. hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra, để hạn chế rủi ro có thể xảy ra. - Thực hiện m-PCR phát hiện đồng thời 2 loại vi khuẩn A. hydrophila (209 bp) và E. ictaluri (407 bp).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Báo Cần Thơ. 2007. Để sản phẩm cá tra Việt Nam luôn được tín nhiệm. http://www.fistenet.gov.vn/detail.asp (Cập nhật 09/08/2007).
2. Bộ Thủy sản, 2008. Phòng trị một số bệnh thường gặp của cá tra và basa. Cập nhật 7/11/2008.
3. Bùi Quang Tề. 2006. Bệnh học thủy sản.
4. Đặng Thị Hoàng Oanh. 2007. Nguyên lý và Kỹ thuật Chẩn đoán Bệnh Thủy sản. Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ.
5. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội. 2004. Bệnh Học Thủy Sản. NXB nông nghiệp, 6:218-223.
6. Đoàn Nhật Phương. 2001. Xác đinh LD50 và thử nghiệm vaccine phòng bệnh vi khuẩn (Aeromonas hydrophila) trên cá chép (Cyprinus carpio). Luận văn tốt nghiệp. khoa Thủy sản, ĐHCT.
7. Hồ Huỳnh Thùy Dương. 2003. Sinh học phân tử. NXB giáo dục. 301 trang.
8. Huỳnh Phú Trọng. 2008. Xuất khẩu thủy sản chạy đua cán đích 4,25 tỷ
USD. http://www.vietlinh.com.vn ( truy cập 22/8/2008).
9. Huỳnh Thị Phượng Quyên. 2008.Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn E. ictaluri
& A. hydrophila tại khoa Thủy sản. Luận văn tốt nghiệp. Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ.
10. Inglis, V., R. J. Roberts and N. R. Bromage. 1993. Bacterial Disease Of Fish. Institute of Aquaculture. 312pp.
11. Khuất Hữu Thanh. 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. NXB khoa học và kỹ thuật.
12. Lê Minh Đương. 2007. So sánh khả năng xâm nhập của hai dòng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn tốt nghiệp. Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ.
13. Lê Thành Đen. 2006. Sử dụng một số hóa chất trị bệnh trùng quả dưa (Ichthyophthyrius multifiliis) trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) giống. Luận văn tốt nghiệp. Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ.
14. Lê Thị Bé Năm. 2002. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng ở
15. Lệ Thu. 2008. Tác động của biến đổi khí hậu đối với ĐBSCL. Báo Cần Thơ. http://www.cres.edu.vn ( Cập nhật 9/10/2008).
16. Lương Trần Thục Đoan. 2006. Khảo sát sự xuất hiện của vi khuẩn gây bệnh mủ gan ( Edwardsiella ictaluri) trên các cơ quan khác nhau của ca tra (Pangasius hypophthamus). Luận văn tốt nghiệp. Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ. 51 trang.
17. Ngô Minh Dung. 2007. nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn
Edwarsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila trên cá tra(Pangasius hypophthalmus). Luận văn đại học. Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ.
18. Nguyễn Hà Giang. 2008. Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định các chỉ
tiêu sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila tại khoa thủy sản. Luận văn tốt nghiệp. Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ.
19. Nguyễn Trúc Phương. 2008. Tìm hiểu sự khác nhau về các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và API 20E. Luận văn tốt nghiệp. Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ. 42 trang.
20. Nông nghiệp, nông sản, thủy sản Việt Nam. 2007. Một số bệnh thường gặp trên cá tra. http://agriviet.com/news_detail420-c46-s67-p0-một số bệnh thường gặp trên cá tra.html. Cập nhật 1/5/2007.
21. Panangala, S.V., C.A. Shoemaker, V.L.V. Santen, K. Dybvig and P.H. Klesius. 2007. Multipex-PCR for simultaneous detection of 3 bacterial fish pathogens, Flavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri, and Aeromonas hydrophila. Díeases of aquatic organisms, 74: 199-208 (2007).
22. Phạm Đình Đôn. 2006. Bảo vệ môi trường trong nuôi trồng thủy sản ở Đồng bằng sông Cửu Long. http://www.vietlinh.com.vn (Cập nhật 26/11/2006).
23. Phạm Thanh Hương. 2006. xác định một số yếu tố huyết học trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) bệnh vàng da ở tỉnh Cần Thơ. Luận văn tốt nghiệp. Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ.
24. Phạm Thị Thu Trang. 2005. Ứng dụng kỹ thuật PCR chuẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú (Penaus monodon) và tôm chân trắng (Penaus vannamie). Luận văn tốt nghiệp. Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ. 39 trang.
25. Saitatu, K.S., Wongsawang and K. Poonsuk. 1982. Red sore disease in carp (Cyprinus carpio L) J. Aquat. Animal Dis. 3: 79-86 (In Thai). In Asian
Fish Health Bibliography and Abstracts I: Southeast Asia. Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992.
26. Tiết Ngọc Trân. 2007. So sánh khả năng gây bệnh của hai dòng vi khuẩn (Edwardsiella ictaluri) gây bệnh trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) và cá nheo mỹ. Luận văn tốt nghiệp. Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ.
27. Trần Khánh Linh. 2007. ĐBSCL: môi trường nuôi thủy sản đang kêu cứu. http://www.monre.gov.vn (Cập nhật 16/11/2007).
28. Trần Thị Ngọc Hân. 2006. Khảo sát mô học cá tra (pangasius hypophthalmus) bị bệnh mủ gan trong điều kiện gây cảm nhiễm. Luận văn tốt nghiệp. Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ. 71 trang.
29. Trần Thị Tuyết Hoa. 2004. Bài Giảng sinh học phân tử. Khoa Thủy Sản-
Đại học Cần Thơ.
30. Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan. 2005. Cơ sở di truyền và công nghệ gen. NXB khoa học và kỹ thuật.
31. Trần Văn Tếch. 2008. Khảo sát ký sinh trùng trên cá tra (Pangasianodon hyphophthalmus) bệnh vàng da. Luận văn tốt nghiệp. Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ.
32. Trần Việt Tiên. 2007. Ứng dụng phương pháp RT-PCR trong chẩn đoán virus gây bệnh đầu vàng (YHV) trên tôm sú (penaeus monodon) ở ĐBSCL. Luận văn tốt nghiệp. Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ. 65 trang.
33. Từ Thanh Dung. 2005. Bài Giảng Bệnh Học Thủy Sản Đại Cương. Khoa Thủy sản – Đại học Cần Thơ.
34. Từ Thanh Dung. 2008. Bài giảng Bệnh vi khuẩn trên động vật Thủy sinh. Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ.
35. Võ Thị Thương Lan. 2006. Giáo trình sinh học phân tử tế bào và ứng dụng. NXB giáo dục.
36. Yang. B, X-L Song, J. Huang, C-Y Shi, Q-H Liu and L. Liu. 2006. A single-step multiplex PCR for simultaneous detection of white spot syndrome virus and infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp.
PHỤ LỤC 1
Bảng các chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập được từ cá bệnh xuất huyết. Địa điểm Kí hiệu ao Tên hộ nuôi Bệnh Dấu hiệu bệnh lý Chủng vi khuẩn Đồng Tháp SĐ2 Phan Văn Điền Xuất huyết Sưng hầu, phù mắt. Xuất huyết nội quan. Xoang bụng có chứa chất dịch màu hồng. SĐ2.1T SĐ2.2T Vĩnh Long CA1 Huỳnh Văn Khuê Xuất huyết Gan có màu vàng, dịch xoang bụng có mùi hôi. Thành bụng xuất huyết CA1.2T CA1.3TT Cần Thơ CS2 Nguyễn Thị Hoà Xuất huyết Cơ bị loét, vây trắng nhạt và xuất huyết. Xuất huyết mặt trong thành bụng, nội quan. Xoang bụng chứa chất dịch có mùi hôi. CS2.3T TN1 Lê Thành Nhân Xuất huyết Phù mắt, xuất huyết hầu, xuất huyết vi. Xuất huyết cơ bụng. Gan có màu vàng. TN1.1T TN2 Lê Thành Nhân Xuất huyết Xuất huyết vi, hậu môn, hầu. Xuất huyết thành bụng và nội quan. Xoang bụng chứa chất dịch có màu vàng mùi hôi TN2.1G TN2.4TT
PHỤ LỤC 2
Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của 8 chủng vi khuẩn phân lập
Chỉ tiêu kiểm tra A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 Nhuộm Gram - - - - Hình dạng Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Sinh sắc tố - - - - Di động + + + + + + + + Sinh catalaza + + + + + + + + Sinh oxidaza + + + + + + + + Phản ứng lên men yếm khí + + + + + + + + Phản ứng lên men hiếu khí + + + + + + + + Arginine + + + + + + + + Lysine + + + + + + + + Ornithine - - - -
Mọc trên môi trường Aeromonas + + + + + + + + Sinh gas từ glucose + + + + + + + + Thuỷ phân aesculin - + + + + - + + Sinh ureaza - - - -
Sử dụng citrate + + + + + + + + Sinh amylaza + + + + + + + + Sinh indole - - - + - + - +
Phản ứng VP - - - -
Thuỷ phân tween 80 - - - -
Tạo nitrit từ nitrat + + + + + + + + Mọc ở 0% NaCl + + + + + + + + Mọc ở 3% + + + + + + + + Mọc ở 6% - - - - Mọc ở 7% - - - - Mọc ở 10% - - - - Mọc trên thạch TCBS - - - - Kháng với 0/129 - - - - Sử dụng Arabinose - - - - Cellobiose - - - - Galactose + + + + + + + + Glycerol + + + + + + + +