- Vi khuẩn được phục hồi bằng cách cấy lên môi trường đặc trưng Aeromonas agar + Ampicillin, ghi nhận kết quả phục hồi vi khuẩn sau 18-24 giờở 28-30oC.
- Chọn một khuẩn lạc thuần từ đĩa Aeromonas agar tách sang đĩa NA ủ ở
28-30oC, sau 18-24 giờ.
- Chon một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm 5ml NB ủ
trong tủấm 28-30oC, sau 18-24 giờ kiểm tra kết quả.
3.3.5 Phương pháp PCR
Chiết tách Acid nucleic (Bartie và ctv, 2006 trích dẫn bởi Nguyễn Trúc Phương, 2008)
Chiết tách Acid nucleic từ vi khuẩn nuôi trong NB
- Nuôi tăng sinh vi khuẩn (18-24 giờ) trong ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường NB.
- Chuyển 1,5 ml dung dịch vi khuẩn sang ống eppendorf.
- Tiếp tục cho vào 100 µl dung dịch TE (10 mM Tris HCl và 1 mM EDTA).
- Ủở 95oC trong vòng 15 phút.
- Làm lạnh nhanh ống eppendorf trong nước đá. - Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút.
- Rút phần dung dịch bên trên sang ống eppendorf mới.
- Đo hàm lượng DNA bằng máy so màu quang phổ (Biomate) ở 260 nm. - Xác định hàm lượng DNA
Đầu tiên, sử dụng nước cất 2 lần để tạo mẫu blank, rồi đo mẫu DNA đã được pha loãng 10 lần (50 µl DNA + 450 µl nước cất 2 lần). Hàm lượng DNA được tính theo công thức.
Hàm lượng DNA (ng/µl) = A260nm x 50 x độ pha loãng.
Chiết tách Acid nucleic từ khuẩn lạc vi khuẩn pha loãng trong dung dịch 0,85% NaCl
- Cho 1,5 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) vào ống eppendorf, tiếp tục dùng que cấy lấy vi khuẩn trên đĩa NA cho vào ống eppendorf.
- Cho thêm 100 µl dung dịch TE vào ống eppendorf và tiếp các bước giống như chiết tách vi khuẩn trong môi trường NB.
Mẫu lấy trực tiếp từ đĩa cấy NA đem khuếch đại
Sau khi chuẩn bị các chất tham gia phản ứng khuếch đại trong ống eppendorf, 24 µl/mẫu (PCR Buffer, MgCl2, dNTPs, Taq DNA polymerase, đoạn mồi AeroFd, đoạn mồi AeroRs, nước cất), dùng đầu col lấy một ít vi khuẩn trên
đĩa nuôi cấy (NA) cọ vào thành eppendorf có chứa các thành phần tham gia phản ứng khuếch đại.
Khuếch đại DNA: (theo Panangala ctv, 2007 có chỉnh sữa bởi Đặng Thị
Hoàng Oanh và ctv, 2008).
Thành phần cho phản ứng
Bảng 3.3 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui trình PCR phát hiện A. hydrophila.
Chu kỳ nhiệt
1. Giai đoạn tiền biến tính: 95 oC trong 4 phút. 2. Tiếp theo là 30 chu kỳ gồm
- Giai đoạn biến tính: 95 oC trong 30 giây. - Giai đoạn gắn mồi: 60 oC trong 45 giây. - Giai đoạn kéo dài chuỗi: 72 oC trong 30 giây.
3. Giai đoạn kéo dài chuỗi cuối cùng: 72 oC trong 10 phút.
Chạy điện di
Chuẩn bị bản thạch (gel )
Pha 1,5 g agarose trong 100 ml dung dịch đệm TAE 0,5X, sau đó đun bằng lò vi sóng cho agarose tan hết, đợi đến khi nhiệt độ giảm xuống còn khoảng 50-
STT Thành phần tham gia phản ứng Hàm lượng Thể tích
1 PCR Buffer 1X 2,5 µl
2 MgCl2 1,5 mM 1,5 µl
3 dNTPs 200 µM 0,5 µl
4 Taq DNA polymerase 2,5 U 0,5 µl
5 Đoạn mồi (AeroFd) 0,4 µM 1 µl
6 Đoạn mồi (AeroRs) 0,4 µM 1 µl
7 DNA mẫu 20 ng 1 µl
8 Nước cất - 17 µl
60 oC cho ethidium bromide (10 mg/ml) vào rồi lắc nhẹ để ethidium bromide tan đều, tiến hành đổ agarose vào khay đựng gel. Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ của khay đựng gel. Thường bề dày của gel không quá 0,8 cm. Khi gel
đặc lại, cẩn thận gỡ lược gel và keo dán 2 bên ra khỏi khay đựng gel. Cho gel vào bồn điện di. Thêm dung dịch điện di cho vừa bao phủ gel. Dùng thang DNA cho từng gel để xác đinh khối lượng phân tử của sản phẩm PCR. Dùng pipette hút 10 µl cho mẫu cần phân tích trộn với một giọt dung dịch nạp mẫu (loading Dye 6X) cho vào từng giếng một.
Điện di
Khi đã cho mẫu cần phân tích vào các giếng còn lại, nối bồn điện di với nguồn
điện để chạy. Sử dụng dòng điện 100-150 V (không vượt quá 150 V) để chạy gel. Ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel. Sau
đó tiến hành đọc kết quả.
Đọc kết quả
Đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả. Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy
đọc gel Vilber Lourmat. Căn cứ vào thang DNA 1 kb plus để xác định trọng lượng phân tử. Trọng lượng phân tử đoạn DNA của vi khuẩn A. hydrophila
cần phát hiện là 209 bp.