3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.3. Nghiên cứu về kỹ thuật nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng
Trong thời gian qua ở nước đã có những nghiên cứu về công nghệ lên men nhân sinh khối để sản xuất chế phẩm sinh học nấm ký sinh côn trùng như
Beauveria và Metarhizium dùng trong phòng trừ sinh học (Phạm Thị Thùy và
Chương II
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu
Đề tài được tiến hành nghiên cứu với các nội dung chính như sau:
1) Đánh giá sinh trưởng của nấm Isaria tenuipes trên môi trường PDA. 2) Đánh giá sinh trưởng của nấm Isaria tenuipes trên môi trường lỏng. 3) Đánh giá sinh trưởng của nấm Isaria tenuipes trên môi trường rắn. 4) Đánh giá khả năng phòng trừ sâu khoang giai đoạn nhộng của nấm
Isaria tenuipes.
2.2. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Nấm ký sinh côn trùng Isaria tenuipes (Peck.) Samson (VN1342) đã được thu thập tại Vườn Quốc Gia Pù Mát, Pù Huống.
- Nhộng sâu khoang (Lepidoptera Litura) ở độ tuổi 1 đến 4.
2.2.2. Vật liệu nghiên cứu
- Nguyên liệu, hóa chất: Khoai tây, Agar, Dextrose, Glucose, Peptone, cồn, glucose, sucrose, peptone, yeast extract, K2HPO4, KH2PO4, CaCl2, MgSO4,...
- Các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, kính hiển vi, tủ lạnh khô, tủ hấp tiệt trùng, buồng nuôi cấy, dụng cụ nuôi cấy,...
2.3. Thời gian và địa điểm
- Thời gian: Tháng 1/2010 - 12/2011.
- Địa điểm: Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Nông nghiệp, khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp nghiên cứu sinh trưởng nấm trên môi trường PDA
Cấy chuyển nấm và thí nghiệm đánh giá sinh trưởng nấm trên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) theo phương pháp của Brown and Smith (1957) và Samson (1974) [65].
Chuẩn bị môi trường
PDA (Potato Dextrose Agar) là môi trường nhiều hyđrat cacbon có chứa 20g glucose, 15g agar và nước luộc 200g khoai tây, trong 1lít nước. Khoai tây gọt vỏ rửa sạch và cắt nhỏ trước khi nấu cho vừa mềm. Bào tử vô tính hình thành trên PDA thường có hình dạng và kích thước không ổn định. Môi trường PDA có thể được dùng để bảo quản, phân lập hoặc làm môi trường nhân giống cấp 1.
Chuẩn bị môi trường PDA gồm 5 bước như sau:
Bước 1: Khoai tây được rửa sạch và gọt vỏ, để ráo nước.
Bước 2: Cân 200g và cắt nhỏ theo kích thước 1,0 x 1,0 cm rồi cho vào
nồi cùng 1000ml nước cất, nấu mềm trong khoảng 45 phút đến 1 giờ.
Bước 3: Lọc lấy dịch chiết và thêm vào 20g glucose + 15g agar +
lượng nước sao cho đủ 1000ml, cho lên bếp từ, vừa đun nóng vừa cho con khuấy từ đánh tan đều.
Bước 4: Cho vào một cái chai loại 1000ml có nắp kín, đem hấp tiệt trùng ở
1210, 20 Phút, 15 psi.
Phương pháp cấy chuyền từ đĩa petri sang đĩa petri
Bước1: Chuẩn bị
Tiến hành khử trùng buồng cấy, tay, khử trùng que cấy bằng cồn 70 %
Bước 2: Mẫu nấm
Những mẫu nấm gốc phải đạt tiêu chuẩn trước khi cấy chuyền
Bước 3: Cách cấy
Có 2 cách để cầm đĩa Petri trong khi cấy nấm, có thể cấy một điểm hoạch nhiều điểm trên đĩa petri
Bước 4: Nuôi dưỡng
Cấy xong, các đĩa petri được xếp vào hộp và đem nuôi trong tủ
colofom 22 - 240C
Hình 2.1. Mô tả các bước cấy nấm trên môi trường PDA
* Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng trên môi trường
PDA tới sinh trưởng và phát triển của nấm Isaria tenuipes.
Trên môi trường PDA tiến hành bổ sung thêm các hàm lượng đường với các mức: CT 1: 20 gam, CT 2: 15 gam và CT 3: 10 gam cho 1 lít môi trường. Mỗi hàm lượng đường là một công thức thí nghiệm.
- Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thể tích môi trường PDA tới sinh trưởng và phát triển của nấm Isaria tenuipes.
Trên môi trường PDA tiến hành đánh giá sinh trưởng của nấm Isaria
tenuipes với các mức môi trường có độ dày CT 1: 1.5 mm, CT 2: 3 mm và CT
3: 5 mm.
Nấm Isaria tenuipes được bố trí nhân nuôi trên các đĩa petri có đường kính 6cm, với 8 lần lặp lại cho 1 công thức thí nghiệm. Trên mỗi đĩa Petri cấy 5 điểm nấm.
• Chỉ tiêu theo dõi
Thí nghiệm tiến hành theo dõi các chỉ tiêu:
- Đặc điểm hình thái khuẩn lạc nấm Isaria tenuipes sinh trưởng trên môi trường PDA.
- Sự sinh trưởng phát triển của nấm Isaria tenuipes theo bề ngang môi trường (đường kính khuẩn lạc).
- Sự sinh trưởng, phát triển chiều cao của khuẩn lạc nấm Isaria tenuipes - Sự phát sinh và hình thành bào tử nấm Isaria tenuipes trên môi trường
PDA.
- Các chỉ tiêu được theo dõi và lấy số liệu định kỳ 3 ngày 1 lần. Riêng chỉ tiêu miêu tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc nấm Isaria tenuipes thì theo dõi và lấy chỉ tiêu theo từng ngày một.
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân sinh khối nấm Isaria tenuipes
Nghiên cứu kỹ thuật nhân sinh khối nấm Isaria tenuipes bằng phương pháp lên men trên môi trường lỏng, tĩnh và trên môi trường rắn nhằm tìm ra môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sinh trưởng và phát sinh bào tử nấm
Isaria tenuipes.
Nhân nuôi sinh khối nấm nấm ký sinh côn trùng dựa theo phương pháp của Chen Y.Q. et al. (2004) [33]; Weiyun Zhang et al. (2005) [46]; Sung- Hom Yeon et al. (2006) [45]; In-Pyo Hong et al. (2010) [43].
• Phương pháp nhân sinh khối
(1) Phương pháp nhân giống cấp I trên môi trường PDA
Môi trường PDA pha chế theo đúng tỉ lệ thành phần các nguyên liệu. Đun sôi sau đó cho dung dịch môi trường vào các ống nghiệm một lượng 5ml/ống nút bông, khử trùng ở nhiệt độ 1210C, thời gian 20 phút, lấy ra để nghiêng ống nghiệm 150. Cấy chuyển giống thuần vào nuôi ở điều kiện nhiệt độ 20 - 240C, thời gian theo dõi nuôi 15 - 20 ngày. Thao tác cấy được tiến hành trên ngọn lửa đèn cồn trong buồng cấy sinh học vô trùng.
(2) Phương pháp nhân giống cấp II
Khi pha chế môi trường nhân giống cấp II cần trộn đều các thành phần nguyên liệu theo tỉ lệ. Sau đó cho hỗn hợp nguyên liệu vào 1/2 bình tam giác cỡ 250ml. Các bình tam giác được nút lại bằng bông sạch. Đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, trong thời gian 50 phút. Sau đó lấy ra để nguội. Cấy chuyển giống cấp I vào theo tỷ lệ 1:1 (1 ống nghiệm giống cấp I cấy chuyển vào 1 bình tam giác cấp II). Nuôi giống cấp II ở nhiệt độ 20 - 240C, độ ẩm không khí 80%, lấy số liệu 5 ngày/lần và trong thời gian 20 ngày.
(3) Phương pháp nhân giống cấp III
Trộn đều các thành phần nguyên liệu theo đúng tỉ lệ, cho hỗn hợp nguyên liệu vào 1/3 bình tam giác cỡ 500ml. Các bình tam giác được nút lại bằng bông sạch. Đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, trong thời gian 50 phút. Sau đó lấy ra để nguội. Cấy chuyển giống cấp II vào theo tỷ lệ 1:15 (1 bình tam giác 250ml làm giống cho 15 bình tam giác 500ml). Nuôi giống cấp III ở nhiệt độ 20 - 240C, độ ẩm không khí 80%, lấy số liệu 5 ngày/lần và trong thời gian 10 - 15 ngày.
(4) Phương pháp thu hồi sinh khối
Sau khi nhân giống trên môi trường lỏng ở cấp 1, 2 và có thể trên môi trường lỏng cấp 3, nấm được chuyển sang các môi trường nhân sinh khối đặc trưng trên môi trường lỏng hoạc rắn.
Khi sợi nấm bao phủ lên toàn bộ thể tích khối môi trường rắn đồng thời quá trình hình thành bào tử kết thúc và bào tử đã được định hình trên bề mặt của môi trường. Tiến hành thu hồi nấm nuôi trên môi trường. Sau đó đem sấy khô ở nhiệt độ 100C, trong 10 - 15h khi độ ẩm của cơ chất và bào tử đạt ngưỡng 5%, nghiền mịn thu được chế phẩm nấm Isaria tenuipes.
Trên môi trường lên men lỏng tĩnh, khi nấm lan tỏa phủ kín hoàn toàn bề mặt môi trường, khối lượng váng nấm và số lượng bào tử đạt tối đa thì tiến hành thu sinh khối nấm. Sau đó đem sấy khô ở nhiệt độ 100C, trong 10 - 15h khi độ ẩm của váng nấm đạt ngưỡng 5%, nghiền mịn thu được chế phẩm nấm hoặc tiến hành bảo quản cho quá trình phân tích thu hoạt chất sinh học trên nấm Isaria tenuipes.
* Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm trên môi trường lỏng
Nhân sinh khối nấm trên môi trường lỏng được bố trí với ba công thức có thành phần môi trường dinh dưỡng như sau:
CT1: 2% sucrose, 0,9% yeast extract, 0,3% KHPO4, 0,4% CaCl2, 1lít nước cất. Môi trường có pH = 6
CT 2: 30g glucose, 4g yeast extract, 0,46g KH2PO4, 1g K2HPO4, 0,5g MgSO4, 1 lít nước cất. Môi trường có pH = 8
CT3: 40g glucose, 10g yeast extract, 0,5g KH2PO4, 0,5g K2HPO4.3H2O, 0,5g MgSO4.7H2O, 1 lít nước cất. Môi trường có pH = 7 Bố trí thí nghiệm với 3 lần lặp lại/1công thức; 30 bình/1công thức. Nấm được nuôi trong các bình tam giác thuỷ tinh có dung tích 500ml với thể tích môi trường nuôi là 100ml, được đặt trên các giá đỡ nuôi trong điều kiện 250C, độ ẩm 80% và có chế độ sáng/tối là 12/12.
- Thí nghiệm trên môi trường rắn
Nấm sinh trưởng và phát triển trên môi trường rắn là gạo lứt có bổ sung thêm các các thành phần dinh dưỡng khác. Thành phần dinh dưỡng của các công thức được bố trí như sau:
CT 1: 100 gam gạo lứt
CT 2: 100 gam gạo lứt + 3 gam sucrose + 2 gam yeast extrac
CT 3: 100 gam gạo lứt + 5 gam nhộng tằm Các công thức đều có tỷ lệ gạo và nước đạt 1: 1,2
Mỗi công thức được bố trí với 3 lần lặp lại. 30 túi bóng/1 lần lặp lại. Các công thức thí nghiệm được bố trí nhân nuôi trong các túi bóng có dung tích 1000 ml. Nấm được nuôi ở điều kiện 250C, độ ẩm 80%, thời gian sáng tối là 12/12.
•Chỉ tiêu theo dõi
Thí nghiệm trên môi trường lỏng tiến hành theo dõi với các chỉ tiêu sau: - Khả năng lan tỏa trên bề mặt môi trường lỏng (%)
- Khối lượng váng nấm (gam)
- Nồng độ bào tử được phát sinh và hình thành (bào tử/1ml) - Thể tích môi trường còn lại, pH của môi trường.
Các chỉ tiêu theo dõi được lấy định kỳ 3 ngày một lần. Thí nghiệm được theo dõi trong thời gian một tháng.
Thí nghiệm trên môi trường lên men rắn theo dõi với các chỉ tiêu như sau: - Khả năng bao phủ trên bền mặt môi trường (%)
- Số lượng bào tử được hình thành (bào tử/1gam)
Các chỉ tiêu được theo dõi lấy định kỳ 3 ngày 1 lần. thí nghiệm được theo dõi trong thời gian 45 ngày.
2.4.3. Phương pháp đánh giá hiệu lực chế phẩm nấm Isaria tenuipes
phòng trừ nhộng sâu khoang hại cây trồng trong phòng thí nghiệm
• Phương pháp
Đánh giá hiệu lực chể phẩm nấm Isaria tenuipes trong phòng trừ nhộng sâu khoang hại cây trồng tuân thủ theo các phương pháp thường quy về thí nghiệm bảo vệ thực vật (Bảo vệ thực vật, 2010).
• Bố trí thí nghiệm
Đánh giá hiệu lực phòng trừ của chế phẩm nấm Isaria tenuipes trên nhộng
phòng trừ nhộng sâu khoang của nấm Isaria tenuipes ở các nồng độ bào tử khác nhau.
Thí nghiệm được tiến hành trên các nồng độ bào tử khác nhau với các công thức được bố trí như sau:
CT 1: nồng độ 106 bào tử/1ml
CT 2: nồng độ 107 bào tử/ml
CT 3: Nồng độ bào tử 108 bào tử/ml
Sau khi nhân nuôi sinh khối nấm trên môi trường lỏng hoặc rắn đạt nồng độ bào tử tối ưu thì pha chế phẩm thành dạng dịch lỏng có nồng độ bào tử thích hợp để phun (pha thêm chất bám dính).
Đối tượng thí nghiệm phòng trừ là nhộng của sâu khoang không bị nhiễm ký sinh thu được từ quá trình nuôi sâu sạch trong phòng thí nghiệm.
Nghiên cứu được tiến hành ở phòng thí nghiệm, trong hộp nhựa 25cm x 20cm x 15cm, số lượng 30 sâu khoang/hộp, thí nghiệm lặp lại 3 lần, CT đối chứng phun nước cất.
•Chỉ tiêu theo dõi
- Số lượng (con) và tỷ lệ (%) sâu khoang chết theo thời gian sau phun nấm - Số lượng (con) và tỷ lệ (%) sâu khoang có nấm mọc theo thời gian sau phun nấm
• Thu thập và xử lý số liệu
Trong phòng thí nghiệm: Hiệu lực của chế phẩm được tiến hành theo công thức Abbott (1925): K (%) = [(Ca - Ta)/Ca)] x 100
Trong đó: K là hiệu lực của chế phẩm sinh học. Ca là số cá thể sống ở công thức đối chứng.
Ta là số cá thể sống ở công thức thí nghiệm sau khi xử lý.
2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu sau khi được thu thập được xử lý trên Microsoft Office Excel 2003
Chương III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Sự phát triển của Isaria tenuipes trên môi trường PDA
3.1.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Isaria tenuipes trên môi trường PDA
Kết quả theo dõi đặc điểm hình thái khuẩn lạc sinh trưởng trên môi trường PDA được trình bày qua bảng 3.1 và hình 3.1. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Khuẩn lạc của nấm Isaria tenuipes phát triển nhanh trên môi trường PDA dạng hình toả tròn và hướng lên trên. Màu sắc khuẩn lạc thay đổi, đầu tiên màu trắng sau đó chuyển sang màu vàng và vàng nhạt khi thành thục. Mặt dưới khuẩn lạc ban đầu có màu trắng sau chuyển dần thành màu vàng ngà, màu vàng đậm khi khuẩn lạc thành thục. Khi bào tử xuất hiện nhiều mặt dưới môi trường khuẩn lạc chuyển từ màu vàng ngà sang màu vàng nâu và cuối cùng chuyển thành màu nâu đậm. Bào tử xuất hiện sau nuôi cấy từ 3 - 7 ngày. Sau 9 - 10 ngày khuẩn lạc bao phủ toàn bộ bề mặt môi trường PDA.
Bảng 3.1. Khả năng sinh trưởng của Isaria tenuipes trên PDA Thời gian
theo dõi Đường kính (mm) Chiều cao (mm)
3 ngày 9,44 4,218
6 ngày 18,83 4,66
9 ngày 26,06 5,046
12 ngày 26,06 4,852
15 ngày 26,11 4,714
Sau ngày thứ 3, bề mặt trên của khuẩn lạc bắt đầu xuất hiện những đường tròn đồng tâm, mặt dưới khuẩn lạc có màu trắng. Ngày thứ 5 - 6 ở giữa
tâm của khuẩn lạc có xu hướng lõm xuống, mặt sau chuyển màu vàng nhạt. Ở tâm khuẩn lạc có màu trắng và đã bắt đầu xuất hiện nhiều bào tử dạng bột màu trắng bao phủ trên bề mặt sợi nấm. Sự xuất hiện bào tử đã ảnh hưởng đến chiều cao của khuẩn lạc. Chiều cao khuẩn lạc tăng từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 8 và đạt đỉnh ở ngày thứ 9 sau đó giảm dần.
Sau 6 ngày, nấm lõm xuống rõ ràng và phân biệt thành 3 đường tròn đồng tâm trên bề mặt PDA. Sợi nấm dạng lông nhu màu vàng nhạt, mềm, có lớp bào tử màu trắng, dạng bột, mỏng bao phủ khắp bề mặt nấm. Sau 7 ngày, giữa tâm của khuẩn lạc bào tử nhô dần lên, dày đặc bào tử.
4 ngày 5 ngày 6 ngày
7 ngày 9 ngày 12 ngày
Hình 3.1. Sự sinh trưởng và phát triển Isaria tenuipes trên môi trường PDA
Sang ngày thứ 9, khuẩn lạc bao trùm toàn bộ bề mặt môi trường, các bào tứ xuất hiện ở các đường tròng đồng tâm phía trong nhiều dần lên. Chiều
cao khuẩn lạc đạt tối đa vào ngày thứ 9 sau đó giảm dần. Vào thời điểm này mặt dưới khuẩn lạc có màu vàng ngà ở các đường tròn đồng tâm vòng ngoài, còn phía trong giữa tâm có màu vàng nâu.
Những ngày tiếp theo bào tử phát sinh bao phủ trên khắp bề mặt khuẩn lạc. Mặt dưới khuẩn lạc chuyển sang màu vàng nâu và nâu đậm.
3.1.2. Ảnh hưởng của thể tích môi trường PDA tới sự sinh trưởng theochiều ngang khuẩn lạc Isaria tenuipes chiều ngang khuẩn lạc Isaria tenuipes
Thí nghiệm tiến hành nhân nuôi nấm Isaria tenuipes trên PDA với ba độ dày môi trường khác nhau: 1,5 mm, 3 mm, 5 mm. Kết quả thí nghiệm ở bảng 3.2 và hình 3.2 cho thấy, thể tích môi trường có ảnh hưởng rõ rệt tới