3. Ý nghĩa của đề tài
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân sinh khối nấm Isaria tenuipes
Nghiên cứu kỹ thuật nhân sinh khối nấm Isaria tenuipes bằng phương pháp lên men trên môi trường lỏng, tĩnh và trên môi trường rắn nhằm tìm ra môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sinh trưởng và phát sinh bào tử nấm
Isaria tenuipes.
Nhân nuôi sinh khối nấm nấm ký sinh côn trùng dựa theo phương pháp của Chen Y.Q. et al. (2004) [33]; Weiyun Zhang et al. (2005) [46]; Sung- Hom Yeon et al. (2006) [45]; In-Pyo Hong et al. (2010) [43].
• Phương pháp nhân sinh khối
(1) Phương pháp nhân giống cấp I trên môi trường PDA
Môi trường PDA pha chế theo đúng tỉ lệ thành phần các nguyên liệu. Đun sôi sau đó cho dung dịch môi trường vào các ống nghiệm một lượng 5ml/ống nút bông, khử trùng ở nhiệt độ 1210C, thời gian 20 phút, lấy ra để nghiêng ống nghiệm 150. Cấy chuyển giống thuần vào nuôi ở điều kiện nhiệt độ 20 - 240C, thời gian theo dõi nuôi 15 - 20 ngày. Thao tác cấy được tiến hành trên ngọn lửa đèn cồn trong buồng cấy sinh học vô trùng.
(2) Phương pháp nhân giống cấp II
Khi pha chế môi trường nhân giống cấp II cần trộn đều các thành phần nguyên liệu theo tỉ lệ. Sau đó cho hỗn hợp nguyên liệu vào 1/2 bình tam giác cỡ 250ml. Các bình tam giác được nút lại bằng bông sạch. Đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, trong thời gian 50 phút. Sau đó lấy ra để nguội. Cấy chuyển giống cấp I vào theo tỷ lệ 1:1 (1 ống nghiệm giống cấp I cấy chuyển vào 1 bình tam giác cấp II). Nuôi giống cấp II ở nhiệt độ 20 - 240C, độ ẩm không khí 80%, lấy số liệu 5 ngày/lần và trong thời gian 20 ngày.
(3) Phương pháp nhân giống cấp III
Trộn đều các thành phần nguyên liệu theo đúng tỉ lệ, cho hỗn hợp nguyên liệu vào 1/3 bình tam giác cỡ 500ml. Các bình tam giác được nút lại bằng bông sạch. Đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, trong thời gian 50 phút. Sau đó lấy ra để nguội. Cấy chuyển giống cấp II vào theo tỷ lệ 1:15 (1 bình tam giác 250ml làm giống cho 15 bình tam giác 500ml). Nuôi giống cấp III ở nhiệt độ 20 - 240C, độ ẩm không khí 80%, lấy số liệu 5 ngày/lần và trong thời gian 10 - 15 ngày.
(4) Phương pháp thu hồi sinh khối
Sau khi nhân giống trên môi trường lỏng ở cấp 1, 2 và có thể trên môi trường lỏng cấp 3, nấm được chuyển sang các môi trường nhân sinh khối đặc trưng trên môi trường lỏng hoạc rắn.
Khi sợi nấm bao phủ lên toàn bộ thể tích khối môi trường rắn đồng thời quá trình hình thành bào tử kết thúc và bào tử đã được định hình trên bề mặt của môi trường. Tiến hành thu hồi nấm nuôi trên môi trường. Sau đó đem sấy khô ở nhiệt độ 100C, trong 10 - 15h khi độ ẩm của cơ chất và bào tử đạt ngưỡng 5%, nghiền mịn thu được chế phẩm nấm Isaria tenuipes.
Trên môi trường lên men lỏng tĩnh, khi nấm lan tỏa phủ kín hoàn toàn bề mặt môi trường, khối lượng váng nấm và số lượng bào tử đạt tối đa thì tiến hành thu sinh khối nấm. Sau đó đem sấy khô ở nhiệt độ 100C, trong 10 - 15h khi độ ẩm của váng nấm đạt ngưỡng 5%, nghiền mịn thu được chế phẩm nấm hoặc tiến hành bảo quản cho quá trình phân tích thu hoạt chất sinh học trên nấm Isaria tenuipes.
* Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm trên môi trường lỏng
Nhân sinh khối nấm trên môi trường lỏng được bố trí với ba công thức có thành phần môi trường dinh dưỡng như sau:
CT1: 2% sucrose, 0,9% yeast extract, 0,3% KHPO4, 0,4% CaCl2, 1lít nước cất. Môi trường có pH = 6
CT 2: 30g glucose, 4g yeast extract, 0,46g KH2PO4, 1g K2HPO4, 0,5g MgSO4, 1 lít nước cất. Môi trường có pH = 8
CT3: 40g glucose, 10g yeast extract, 0,5g KH2PO4, 0,5g K2HPO4.3H2O, 0,5g MgSO4.7H2O, 1 lít nước cất. Môi trường có pH = 7 Bố trí thí nghiệm với 3 lần lặp lại/1công thức; 30 bình/1công thức. Nấm được nuôi trong các bình tam giác thuỷ tinh có dung tích 500ml với thể tích môi trường nuôi là 100ml, được đặt trên các giá đỡ nuôi trong điều kiện 250C, độ ẩm 80% và có chế độ sáng/tối là 12/12.
- Thí nghiệm trên môi trường rắn
Nấm sinh trưởng và phát triển trên môi trường rắn là gạo lứt có bổ sung thêm các các thành phần dinh dưỡng khác. Thành phần dinh dưỡng của các công thức được bố trí như sau:
CT 1: 100 gam gạo lứt
CT 2: 100 gam gạo lứt + 3 gam sucrose + 2 gam yeast extrac
CT 3: 100 gam gạo lứt + 5 gam nhộng tằm Các công thức đều có tỷ lệ gạo và nước đạt 1: 1,2
Mỗi công thức được bố trí với 3 lần lặp lại. 30 túi bóng/1 lần lặp lại. Các công thức thí nghiệm được bố trí nhân nuôi trong các túi bóng có dung tích 1000 ml. Nấm được nuôi ở điều kiện 250C, độ ẩm 80%, thời gian sáng tối là 12/12.
•Chỉ tiêu theo dõi
Thí nghiệm trên môi trường lỏng tiến hành theo dõi với các chỉ tiêu sau: - Khả năng lan tỏa trên bề mặt môi trường lỏng (%)
- Khối lượng váng nấm (gam)
- Nồng độ bào tử được phát sinh và hình thành (bào tử/1ml) - Thể tích môi trường còn lại, pH của môi trường.
Các chỉ tiêu theo dõi được lấy định kỳ 3 ngày một lần. Thí nghiệm được theo dõi trong thời gian một tháng.
Thí nghiệm trên môi trường lên men rắn theo dõi với các chỉ tiêu như sau: - Khả năng bao phủ trên bền mặt môi trường (%)
- Số lượng bào tử được hình thành (bào tử/1gam)
Các chỉ tiêu được theo dõi lấy định kỳ 3 ngày 1 lần. thí nghiệm được theo dõi trong thời gian 45 ngày.
2.4.3. Phương pháp đánh giá hiệu lực chế phẩm nấm Isaria tenuipes
phòng trừ nhộng sâu khoang hại cây trồng trong phòng thí nghiệm
• Phương pháp
Đánh giá hiệu lực chể phẩm nấm Isaria tenuipes trong phòng trừ nhộng sâu khoang hại cây trồng tuân thủ theo các phương pháp thường quy về thí nghiệm bảo vệ thực vật (Bảo vệ thực vật, 2010).
• Bố trí thí nghiệm
Đánh giá hiệu lực phòng trừ của chế phẩm nấm Isaria tenuipes trên nhộng
phòng trừ nhộng sâu khoang của nấm Isaria tenuipes ở các nồng độ bào tử khác nhau.
Thí nghiệm được tiến hành trên các nồng độ bào tử khác nhau với các công thức được bố trí như sau:
CT 1: nồng độ 106 bào tử/1ml
CT 2: nồng độ 107 bào tử/ml
CT 3: Nồng độ bào tử 108 bào tử/ml
Sau khi nhân nuôi sinh khối nấm trên môi trường lỏng hoặc rắn đạt nồng độ bào tử tối ưu thì pha chế phẩm thành dạng dịch lỏng có nồng độ bào tử thích hợp để phun (pha thêm chất bám dính).
Đối tượng thí nghiệm phòng trừ là nhộng của sâu khoang không bị nhiễm ký sinh thu được từ quá trình nuôi sâu sạch trong phòng thí nghiệm.
Nghiên cứu được tiến hành ở phòng thí nghiệm, trong hộp nhựa 25cm x 20cm x 15cm, số lượng 30 sâu khoang/hộp, thí nghiệm lặp lại 3 lần, CT đối chứng phun nước cất.
•Chỉ tiêu theo dõi
- Số lượng (con) và tỷ lệ (%) sâu khoang chết theo thời gian sau phun nấm - Số lượng (con) và tỷ lệ (%) sâu khoang có nấm mọc theo thời gian sau phun nấm
• Thu thập và xử lý số liệu
Trong phòng thí nghiệm: Hiệu lực của chế phẩm được tiến hành theo công thức Abbott (1925): K (%) = [(Ca - Ta)/Ca)] x 100
Trong đó: K là hiệu lực của chế phẩm sinh học. Ca là số cá thể sống ở công thức đối chứng.
Ta là số cá thể sống ở công thức thí nghiệm sau khi xử lý.