Kiểu gen của thai Số thai Tỷ lệ %
Bình thƣờng (αα/αα) 11 19,6 Dị hợp tử 36 64,2 (--SEA/αα) 25 44,6 (-α3,7/αα) 4 7,1 (-α4,2/αα) 2 3,5 (-αHbQs/αα) 1 1,7 (-αHbCs/αα) 4 7,1 Mắc HbH 9 16,0 (--SEA/-α4,2 ) 1 1,7 (--SEA/-αHbCs ) 7 12,5 (--SEA/-αc,2delT ) 1 1,7 Tổng 56 100
Nhận xét: Chẩn đoán trước sinh cho 56 thai có nguy cơ mắc HbH, phát hiện 11 thai bình thường (19,6%), 36 thai dị hợp tử (64,2%), và 9 thai mắc bệnh HbH (16,0%). Thai dị hợp tử đột biến (--SEA/αα) chiếm tỷ lệ cao nhất là 44,6%, tiếp theo là dị hợp tử đột biến (-α3.7/αα) và (-αHbCs/αα) cùng chiếm 7,1%. Thai mắc HbH có kiểu gen (--SEA/-αHbCs
) cao nhất chiếm 12,5%.
3.3.3.3. T ng hợp kết quả chẩn đoán trước sinh của bệnh Hb Bart’s và HbH Bảng 3.44. T ng hợp kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh D-thalassemia
Nguy cơ bệnh Số thai Kết quả chẩn đốn trƣớc sinh (%) Bình thƣờng Dị hợp tử Thai bệnh Hb Bart’s 123 (100%) 47 (38,2%) 32 (26,0%) 44 (35,7%) HbH 56 (100%) 11 (19,6%) 36 (64,2%) 9 (16,0%) Tổng 179 (100%) 58 (32,4%) 68 (38%) 53 (29,6%) Nhận xét: Chẩn đoán trước sinh cho tổng số 179 sản phụ, trong đó có 123 sản phụcó nguy cơ sinh con phù thai do Hb Bart’s, và 56 sản phụcó nguy cơ sinh con mắc HbH. Kết quả chẩn đoán trước sinh phát hiện tổng số 58/179 (32,4%) thai khoẻ mạnh, 68/179 (38%) thai dị hợp tử 68/179 (37,9%), 53/179 (29,6%) thai mắc bệnh.
Nhận xét: (A) Hình ảnh điện di sản phẩm GAP-PCR chẩn đoán trước sinh bệnh HbH. Mẫu 1,2,3 là mẫu chứng của người bình thường, dị hợp --SEA/αα, dị hợp -α3.7/αα. Mẫu bố là người dị hợp -α3.7/αα. Mẫu mẹ là người dị hợp --SEA/αα. Thai nhi mắc HbH --SEA/-α3.7
. (B) Hình ảnh điện di sản phẩm GAP- PCR chẩn đoán trước sinh bệnh Hb Bart’s. Mẫu 1,2,3 là mẫu chứng của người bình thường, dị hợp --SEA/αα, đồng hợp --SEA/--SEA. Mẫu bố và mẹ đều là người dị hợp --SEA/αα. Thai mắc hội chứng phù thai do Hb Bart’s --SEA/--SEA.
3.3.3.4. Đối chiếu kết quả chẩn đốn trước sinh
Có 3/44 thai mắc Hb Bart’s được thu thập máu cuống rốn trong quá trình đình chỉ thai, đểđối chiếu với kết quả chẩn đoán trước sinh. Các kết quả chẩn đoán sau sinh và trước sinh đều hoàn toàn phù hợp.
Hình 3.16. Máu cuống rốn thu thập từ thai bị phù mắc Hb Bart’s (A): Công thức máu, (B): Điện di hemoglobin có 100% là Hb Bart’s (A): Cơng thức máu, (B): Điện di hemoglobin có 100% là Hb Bart’s
CHƢƠNG 4 BÀN LUẬN
4.1. Về đột biến gen D globin gây bệnh D-thalassemia phát hiện bằng kỹ
thuật PCR, MLPA và giải trình tự gen
Các đột biến gây bệnh D-thalassemia hầu hết là các đột biến đã biết, được xác định bằng nhiều loại kỹ thuật khác nhau dựa trên nền tảng của kỹ thuật PCR. Quyết định lựa chọn kỹ thuật nào ứng dụng vào chẩn đoán chủ yếu tuỳ thuộc vào việc xác định đặc điểm các đột biến gây bệnh phổ biến ở từng quần thể, và tuỳtheo năng lực của mỗi trung tâm chẩn đoán [61, 86]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn các kỹ thuật ARMS-PCR, GAP-PCR, MLPA và giải trình tự gen để phát hiện các đột biến gen D globin gây bệnh D-thalassemia.
4.1.1. Ứng dụng kỹ thuật PCR, MLPA, giải trình tự gen Sanger xác định
đột biến gen D globin
4.1.1.1. Ứng dụng k thuật GAP-PCR xác định đột biến mất đoạn thường gặp trên gen D globin
GAP-PCR là kỹ thuật được sử dụng phổ biến để phát hiện hầu hết các đột biến mất đoạn thường gặp của cụm gen D globin, chứng tỏ là một trong các kỹ thuật hiệu quả nhất để phát hiện 7 đột biến thường gặp trên gen D globin, chiếm khoảng 80% các đột biến ở hầu hết các quần thể [87]. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ cho phép phát hiện các đột biến đã xác định được chính xác điểm đứt gãy, và đơi khi phản ứng thất bại do có sự thay đổi ngẫu nhiên của các nucleotid trong vùng trình tự mà cặp mồi đã thiết kế tương ứng. Về mặt kỹ thuật, khuyếch đại cụm gen α globin đòi hỏi các điều kiện trong phản ứng PCR phải nghiêm ngặt, do trình tự gen α globin mang hàm lượng GC nhiều hơn và có tính tương đồng cao, vì vậy các cặp mồi đơi lúc không đạt đến hoạt động tối ưu. Để khắc phục nhược điểm này, các cặp mồi được thiết kế với tính năng cao hơn, và bổ sung một số hoạt chất vào phản ứng. Các
cặp mồi chúng tôi sử dụng trong GAP-PCR cho bệnh α-thalassemia đã được thiết kế dưới đạng đa mồi, và được sàng lọc trong cùng một phản ứng, nhằm giảm bớt các thao tác và thời gian thực hiện kỹ thuật [1]. Các cặp mồi này được thiết kế đi qua điểm đứt gẫy của mỗi một đột biến kể trên, mỗi đột biến này được nhận diện dựa trên kích thước tương ứng của mỗi loại. Do 5 loại đột biến này đều bao gồm sự mất đoạn của gen D2, do đó việc khuếch đại gen D2 sẽ cho phép xác định các đột biến này có kiểu gen đồng hợp hay dị hợp tử, dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của gen D2.
Quy trình phân tích gen D1 và D2 được thực hiện theo phương pháp của Samuel S. Chong [43], trong đó, đột biến --DTHAI được mơ tả bởi Winichagoon [84] lần đầu tiên trên quần thể của người Thailand. Nếu bệnh nhân dị hợp tử với 1 đột biến, hình ảnh điện di sẽ có 2 băng, trong đó một băng tương ứng với gen D2 bình thường ởkích thước 1800bp, băng còn lại tương ứng với loại đột biến dị hợp tử mà bệnh nhân có, ở các kích thước tương ứng: --SEA (1394 bp); -D3.7 (2022 bp), -D4.2
(1628 bp); --THAI (1166 bp); --FIL (1024 bp). Nếu bệnh nhân dị hợp tử kép với hai đột biến, hình ảnh điện di sẽ có hai băng tương ứng với hai loại đột biến khác nhau. Nếu bệnh nhân đồng hợp tử đột biến mất đoạn hai gen, hình ảnh điện di sẽ có một băng ở vị trí của loại đột biến mất đoạn hai gen đó. Nếu bệnh nhân đồng hợp tử đột biến mất đoạn một gen, hình ảnh điện di sẽ có một băng ở kích thước tương ứng với vị trí của đột biến mất đoạn một gen đó.
4.1.1.2. Ứng dụng k thuật MLPA xác định đột biến mất đoạn hiếm gặp trên gen D globin
MLPA được sử dụng đểxác định các đột biến gây bệnh khơng nằm trong nhóm kỹ thuật PCR phát hiện được, hoặc trong một sốtrường hợp MLPA được sử dụng như một kỹ thuật thứhai để đối chiếu. Kỹ thuật dựa trên các độ dài khác nhau được đánh dấu bằng các tín hiệu huỳnh quang, nên có thể phân tích được khoảng 50 cặp đầu dò khác nhau, trải trên một vùng gen rộng [88] [89].
Chúng tôi sử dụng bộ kit thương mại (SALSA MLPA kit P140B2 HBA, MRC-Holland, The Netherlands), với 26 cặp probe được sử dụng, gắn trên vùng gen dài 130 kb của cụm gen D globin, từ gen POLR3K đến đầu 3’ của gen D1. Ngồi ra, cịn bao gồm cả vùng HS-40 và tất cả các vùng gen mã hố cịn lại (], D1, D2). Hỗn hợp đầu dò còn bao gồm 12 probes tham chiếu đánh dấu vào các vị trí khác ngồi 26 vị trí kể trên trên vùng gen 16p13.3, được sử dụng như bộ chứng nội kiểm cho mỗi mẫu. Tín hiệu của các đầu dị được xác định bằng cách chia chiều cao đỉnh của mỗi sản phẩm khuếch đại trên tổng chiều cao của đỉnh đầu dò đối chứng (reference probe) trong hỗn hợp đầu dò. Sau đó, mỗi đỉnh bình thường (normalized probe) lại được chia cho chiều cao trung bình của các đỉnh bình thường cho các mẫu chứng bình thường.
Trên các cơng bố của y văn thế giới, kỹ thuật MPLA được sử dụng phổ biến trong việc phát hiện các đột biến mất đoạn hiếm gặp của bệnh D-thalassemia. Nghiên cứu năm 2011 ở Brazil, MLPA được sử dụng để xác định kiểu gen của 8 bệnh nhân HbH có kiểu hình khơng tương ứng với kiểu gen đã được xác định bằng kỹ thuật PCR [90]. Ngoài ra, các nghiên cứu khác tại Phần Lan năm 2010 trên 48 có hồng cầu nhỏ, nhược sắc, HbA2 giảm [91], tại Nam Trung Quốc năm 2008 trên 118 mẫu DNA trong đó có 90 bệnh nhân D-thalassemia và 28 người bình thường khoẻ mạnh [92], tại Ý năm 2010 trên 25 bệnh nhân nghi ngờ mắc HbH nhưng chưa xác định được đột biến bằng các kỹ thuật thơng thường, nghiên cứu có so sánh độ nhạy và đặc hiệu của kỹ thuật MLPA với kỹ thuật Southern Blot và Realtime PCR [93]. Các nghiên cứu này khẳng định kỹ thuật MLPA là một kỹ thuật nhanh chóng, chính xác cho phép xác định đột biến gây bệnh D-thalassemia, đặc biệt đối với các đột biến mất đoạn lớn hiếm gặp.
4.1.1.3. Ứng dụng k thuật ARMS-PCR xác định đột biến điểm thường gặp trên gen D globin
Kỹ thuật ARMS-PCR đã được nhiều y văn quốc tế [41-43] và trong nước [81] công bố là một trong các kỹ thuật phổ biến nhất được sử dụng để
phát hiện các đột biến điểm đã biết trong chẩn đoán bệnh α-thalassemia. Đây là kỹ thuật nhanh, đơn giản, khơng gắn phóng xạ, cho phép sàng lọc nhiều đột biến khác nhau trên cùng một bệnh nhân. Vì vậy, chúng tơi lựa chọn kỹ thuật này để phát hiện haiđột biến điểm thường gặp là -αHbCs
và -αHbQs .
Nhược điểm của kỹ thuật này là đòi hỏi các tiêu chuẩn nghiêm ngặt, cần tối ưu hoá các điều kiện phản ứng cho từng cặp mồi đặc hiệu với mỗi đột biến. Nếu khơng có thể xảy ra âm tính giả hoặc dương tính giả. Phản ứng PCR sẽ chỉ khuyếch đại được đoạn DNA cần thiết khi có được sự bắt cặp hồn chỉnh giữa trình tự đích và mồi. Ngồi ra, trong một quần thể đa dân tộc, với phổ đột biến rộng, thì ARMS-PCR khơng phải là kỹ thuật được khuyến cáo đầu tiên để xác định đột biến [94].
Quy trình phân tích được thực hiện theo phương pháp của Samuel S. Chong [43]. Dựa trên sự có mặt của băng tương ứng với đột biến -DHbCs (183bp) hoặc -DHbQs
(138bp), có thể nhận định về đặc điểm của bệnh nhân mang các đột biến này ở dạng nào, đồng hợp tử, dị hợp tử hay dị hợp tử kép với hai đột biến khác nhau.
4.1.1.4. Ứng dụng k thuật giải trình tự gen xác định đột biến điểm hiếm gặp trên gen D globin
Gen D globin có chiều dài khoảng 1.2kb, gồm 2 gen D1 và D2. Có hơn 50 loại đột biến điểm trên gen D globin đã được công bố, ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein, dẫn đến không hoặc suy giảm tổng hợp, hoặc tạo chuỗi D globin không bền vững. Các đột biến này phân bố với tần suất khác nhau ở các chủng tộc và khu vực khác nhau trên thế giới [61]. Đối với các đột biến điểm hiếm gặp, chúng tơi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen Sanger để phát hiện. Nghiên cứu của chúng tơi có 9 bệnh nhân mang đột biến điểm hiếm gặp được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự, chiếm 8,2% trên tổng số bệnh nhân HbH, gồm các kiểu gen (--SEA/-αc.2delT
), (--SEA/-αc.92 GoA), (--SEA/-αc.426 AoT
), (--SEA/-αc.81G>T ).
4.1.2. Vềđột biến gen D globin trên người nghi ngờ mắc D-thalassemia
Do sự phối hợp giữa các allen D0
-thalassemia và D+
-thalasemia, tạo nhiều kiểu gen khác nhau, dẫn đến bệnh D-thalassemia có kiểu hình đa dạng. Việc chẩn đốn xác định bệnh và thể bệnh D-thalassemia dựa trên phân tích gen D globin có vai trị quan trọng trong điều trị, tiên lượng, tư vấn di truyền. Căn cứ trên các biểu hiện lâm sàng, bệnh nhân được nghi ngờ mắc D-thalassemia: tan máu, thiếu máu nhẹ, trung bình và nặng, gan lách to, vàng da, chậm lớn, có bộ mặt thalassemia, có tiền sử truyền máu hoặc chưa từng phải truyền máu. Tuy nhiên, các biểu hiện lâm sàng này đều khơng đặc hiệu. Nên việc chẩn đốn xác định bệnh D-thalassemia, đặc biệt với người mang gen bệnh và các thể bệnh khơng có triệu chứng cần dựa vào các xét nghiệm cận lâm sàng để khẳng định [87].
Cơ sở xét nghiệm đầu tiên là phân tích cơng thức máu. Hầu hết người mắc D-thalassemia đều có thiếu máu hồng cầu nhỏ, nhược sắc, MCV, MCH giảm, HbA2 giảm nhẹ hoặc bình thường. Khi mức tổng hợp chuỗi D globin giảm dưới 70%, thì chuỗi J globin được tăng tổng hợp từừ thời kỳ bào thai, tạo J4 là Hb Bart’s, có thể được phát hiện khi điện di Hemgolobin ở giai đoạn ngay sau khi sinh [24]. Trong quá trình trưởng thành, chuỗi E globin tăng tổng hợp tạo E4 là HbH, cũng có thể được phát hiện trên phân tích thành phần hemoglobin. Tất cả các thơng sốtrên đều có vai trị trong chẩn đốn bệnh D-thalassemia, nhưng đều khơng có giá trị chẩn đốn xác định bệnh [95]. Chỉ có xét nghiệm phân tích gen D globin mới có giá trị khẳng định chẩn đoán bệnh và thể bệnh [13].
Có 299 bệnh nhân nghi ngờ mắc D-thalassemia trên lâm sàng được chỉ định làm xét nghiệm phân tích gen D globin. Tỷ lệ phát hiện đột biến của người mắc D-thalassemia là 61,5%. Trong đó 32,4% là người mắc HbH (97/299), 29,1% là người mang đột biến dị hợp tử (87/299), 38,1% không phát hiện thấy đột biến (114/299). Đặc biệt, chúng tôi phát hiện duy nhất một trường hợp bệnh nhân mắc Hb Bart’s đồng hợp tử đột biến D0
(--SEA/--SEA), hiện 4 tuổi. Trong số 87 bệnh nhân dị hợp tử gen D globin, chỉ phát hiện 2 loại đột biến là dị hợp tửđột biến --SEA (91,9%) và -D3.7
(9,1%).
4.1.3. Về tỷ lệcác đột biến gen D globin trên bệnh nhân HbH
Có 97 bệnh nhân mắc bệnh HbH đã được chẩn đoán xác định bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Trong đó, 32% thuộc nhóm HbH dạng mất đoạn (--/-D), 68% thuộc nhóm HbH dạng khơng mất đoạn (--/-DT
).
Bảng 4.1. So sánh tỷ lệ HbH mất đoạn và không mất đoạn ở các quần thể
Khu vực HbH (--/-D) HbH (--/DT ) Ref. Bắc Thái Lan 44/102 (43%) 58/102 (57%) 2005 [96] Hồng Kong 87/114 (76%) 27/114 (24%) 2000 [51] Sardina 130/154 (84%) 24/154 (16%) 1992 [97] Ai Cập 41/61 (67%) 20/61 (33%) 2000 [98] Thái Lan 83/147 (56%) 64/147 (44%) 2009 [36] Cali, Mỹ 69/89 (77,5%) 20/89 (22,5%) 2001 [99] Địa Trung Hải 216/251 (86%) 36/251 (14%) 2007 [97] Việt Nam 31/97 (32%) 66/97 (68%) 2017 Tỷ lệ về kiểu gen của bệnh HbH rất khác nhau ở các nghiên cứu trên các chủng tộc khác nhau. Một nghiên cứu trên 595 bệnh nhi mắc HbH ở Guangxi Trung Quốc, tỷ lệ HbH dạng (--/-D) là 59,5%, dạng (--/DT
) là 40,5% [100]. Ở Thái Lan, tỷ lệ này có sự khác nhau giữa miền Bắc và miền Nam. Ở miền Bắc, 56% bệnh nhân thuộc nhóm (--/-D) và 44% bệnh nhân thuộc nhóm (--/DT
), trong khi ở miền Nam tỷ lệnày có xu hướng ngược lại, lần lượt là 47% và 53% [36] [96]. Ở Hong Kong, Cyprus, Sardina và Canada thì tỷ lệ (--/DT
) lại thấp hơn hẳn, lần 24-30%, 15%, 14% và 12% [51], [97], [42, 101]. Như vậy, tỷ lệ bệnh nhân HbH dạng (--/DT
) trong nghiên cứu của chúng tôi là cao nhất so với các nghiên cứu kể trên (Bảng 4.1). Nhóm HbH dạng (--/DT) thường có biểu hiện lâm sàng sớm và nặng, trong khi nhóm bệnh nhân HbH dạng (--/-D)
thường có biệu hiện lâm sàng nhẹ hoặc khơng có biểu hiện lâm sàng có thể nhận thấy, thường do tình cờ phát hiện khi làm xét nghiệm công thức máu hoặc vì triệu chứng bệnh rõ lên khi mắc một bệnh lý khác kèm theo. Do đó, thực tế các bệnh nhân chỉ đến Viện khám khi có các dấu hiệu lâm sàng rõ, hoặc cần phải can thiệp điều trị. Điều này có thể giải thích số bệnh nhân HbH dạng (--/DT
) trong nghiên cứu của chúng tôi gặp nhiều hơn dạng (--/-D).
4.1.3.1. Về đột biến mất đoạn hai gen thường gặp (--SEA, --THAI , --FIL)
Đột biến --SEAlà đột biến mất hai gen trên cùng một NST phổ biến nhất Đông Nam Á, tạo allen D0
-thalassemia. Tất cả các bệnh nhân HbH trong nghiên cứu đều có đột biến --SEA, khơng có bệnh nhân nào có đột biến --THAI