4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
2.2 Công thức pha dung dịch tạo một gel
HÓA CHẤT (1 GEL) 12 % gel phân tách (ml) 5 % gel cô mẫu (ml)
Nước cất 1,6 0,68 30 % Acrylamide 2 0,17 1,5 M Tris H (pH = 8,8) 1,3 - 1 M Tris HCl ( pH = 6,8) - 0,13 10% SDS 0,1 0,04 10% Amonium persulfate 0,05 0,01 TEMED 0,002 0,001
Bước 3: Tiến hành điện di
+ Bơm 10 μl dung dịch ly trích protein vào mỗi giếng của gel. + Cho 1 giọt chất chỉ thị màu Bromophenol vào mỗi gel.
+ Chỉnh đến 20 V đối với gel cô mẫu và 60 V đối với gel phân tách. + Ngừng điện di khi chất chỉ thị cách đáy gel từ 0,5-1 cm.
Bước 4: Nhuộm và rửa gel
+ Gel được nhuộm bằng dung dịch Cooomassie Brilliant Blue R-250 0,2%, lắc nhẹ trong 30-45 phút.
+ Loại bỏ thuốc nhuộm. + Rửa gel bằng Autowave.
Bước 5: Đọc kết quả và bảo quản gel
Phương pháp xác định hàm lượng protein
Tiến hành theo phương pháp Lowry O.H. (1951).
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch ly trích
+ Dung dịch NaOH 0,1 N.
19 + Dung dịch B (CuSO4 0,1%). + Dung dịch C (A:B = 45 :5). + Dung dịch Folin 1 N
Bước 2: Chuẩn bị mẫu
+ Cân 10 mg bột gạo + 1 ml NaOH 0,1 N. + Lắc ít nhất 2 giờ hay để qua đêm.
Bước 3: Pha loãng mẫu và đo
+ Ly tâm mẫu 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
+ Hút 50 μl mẫu + 5 ml dung dịch C. Đối với mẫu blank, thay dung dịch ly trích bằng 50 μl NaOH 0,1 N.
+ Trộn đều và để yên trong 10 phút.
+ Thêm 50 μl Folin 1 N, trộn đều và để yên trong 30 phút.
+ Lắc đều mẫu, sau đó cho vào cuvette và đo ở bước sóng 580 nm.
Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
+ Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA). + Đường chuẩn có dạng:
Y = aX + b
+ Trong đó Y: Độ hấp thụ OD.
X: Lượng protein có trong mẫu đem đo. + Hàm lượng protein được tính theo cơng thức:
Cơng thức: 100
100 %P X
Phương pháp xác định hàm lượng Amylose
Tiến hành theo phương pháp Cagampang and Rodriguez (1980).
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch
+ Ethanol 95%. + HCl 30%. + NaOH 1N.
20
Bước 2: Chuẩn bị mẫu
+ Cân 50 mg bột gạo đã được nghiền mịn, cho vào ống 50 ml. + Thêm 0,5 ml ethanol 95%, lắc nhẹ cho tan đều.
+ Thêm 9,5 ml NaOH 1N. Đun sôi trong 10 phút và lắc đều. + Để qua đêm ở nhiệt độ phòng.
Bước 3: Pha loãng và đo mẫu
+ Rút 100 μl dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử thay dịch trích bằng 100 μl NaOH 1 N).
+ Thêm nước cất khoảng ½ bình, lắc đều. + Thêm 250 μl HCl 30%, lắc đều.
+ Thêm 250 μl dung dịch Iod, lắc đều. + Thêm nước cất đến vạch định mức.
+ Chuyển sang ống 50 ml, lắc đều và để yên trong 30 phút.
+ Lắc đều trước khi cho vào cuvette. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 580 nm. Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
+ Đường chuẩn có dạng: Y = aX + b
Trong đó Y: Độ hấp thụ OD
X: Lượng amylose có trong mẫu đem đo (mg/ml). + Tính hàm lượng amylose theo cơng thức:
100
2 %Amylose X
+ Đánh giá hàm lượng amylose theo thang đánh giá của IRRI (1988) được trình bày như ở Bảng 2.3
21