PHƢƠNG TIỆN - PHƢƠNG PHÁP
2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
Đề tài giám định tác nhân nấm gây bệnh trên cà chua sau thu hoạch được thực hiện tại phịng thí nghiệm phịng trừ sinh học và khu vực nhà lưới thuộc bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Khoa Nông Nghiệp và SHƯD – Trường Đại học Cần Thơ từ tháng 04 năm 2012 đến tháng 04 năm 2013.
2.1.1 Thời gian thu mẫu và giám định
Các mẫu cà chua được thu và giám định các thành phần nấm gây bệnh trên trái sau thu hoạch từ tháng 4 năm 2012 đến tháng 1 năm 2013 tại các chợ và siêu thị trên địa bàn quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ. Quá trình thu mẫu được tiến hành định kỳ từ 2-3 tuần vào các buổi sáng hoặc chiều.
2.1.2 Địa điểm thu mẫu
Cà chua được thu tại các chợ như chợ Xuân Khánh (đường 30/4, phường Xuân Khánh, quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ), chợ Hưng Lợi (quốc lộ 91B, phường Hưng Lợi, Tp Cần Thơ), chợ Tân An (71, đường Hai Bà Trưng, phường Tân An, quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ), siêu thị Big C Cần Thơ ( Lô số 1, khu dân cư Hưng Phú 1, quận Cái Răng, Tp Cần Thơ), siêu thi CoopMart Cần Thơ (số 1, Hịa Bình, phường Tân An, quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ).
2.2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 2.2.1 Các loại môi trƣờng đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 2.2.1 Các loại mơi trƣờng đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
Mơi trường Water Agar (WA) (Atlas, 2004)
Agar 20 g
Nước cất 1000 ml
Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) (Shurtleff và Averre, 1999)
Khoai tây 200 g
Đường (Dextrose) 20 g
Agar 15 g
2.2.2 Các dụng cụ và thiết bị
Các loại dụng cụ trong phịng thí nghiệm như: đĩa Petri, bình tam giác, bọc nilon, đèn cồn, đũa cấy, kim mũi giáo, kéo, kẹp, giấy thấm,…
Các thiết bị hỗ trợ trong phịng thí nghiệm tủ thanh trùng khơ, tử thanh trùng ướt, tủ úm, tủ cấy, cân điện tử, máy đo pH, kính hiển vi, kính lúp soi nổi, lame, lamelle,…
2.3 PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.3.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu bệnh 2.3.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu bệnh
Chọn những mẫu cà chua có dấu hiệu bị tác nhân gây hại. Cho mẫu trái bệnh vào bao giấy (hoặc túi nilon) đem về phịng thí nghiệm tiến hành quan sát, chụp hình lại vết bệnh, ghi chép biểu hiện của vết bệnh và tiến hành phân lập.
2.3.2 Phƣơng pháp xác định thành phần nấm gây hại
Nấm gây bệnh được xác định dựa vào sự phát triển của tản nấm trên mơi trường, đặc điểm và kích thước của bào tử, đính bào đài. Q trình giám định bệnh cây được thực hiện theo 4 bước của quy trình Koch (Agrios, 2005):
Bƣớc 1: Mô tả triệu chứng và tìm mầm bệnh trong mơ bệnh
Sau khi thu mẫu bệnh về phịng thí nghiệm, tiến hành quan sát vết bệnh bằng mắt thường và kính soi nổi để thấy rõ các đặc điểm của vết bệnh như: màu sắc, độ lồi lõm của vết bệnh, có hay khơng có đường viền giữa mơ bệnh và mơ khoẻ, màu sắc và sự phát triển của nấm và ghi chép lại. Sau đó, tiến hành quan sát dưới kính hiển vi để xác định tác nhân gây bệnh bằng cách làm tiêu bản từ lớp nấm phát triển trên mô bệnh lúc mới thu về.
Nếu khơng có nấm phát triển trên mơ trái hoặc khi quan sát dưới kính hiển vi nhưng không quan sát được bào tử của nấm thì tiến hành ủ bệnh trong vịng 2-3 ngày trong điều kiện có ẩm độ cao.
Bƣớc 2: Phân lập và tách ròng mầm bệnh
- Quan sát tác nhân gây bệnh dưới kính soi nổi: Mẫu trái bệnh khi ủ 2-3 ngày, đem quan sát dưới kính soi nổi để ghi nhận màu sắc và cách mọc của từng loài nấm, tiến hành chụp hình lại vết bệnh trên trái bệnh.
- Quan sát dưới kính hiển vi: sau khi quan sát dưới kính hiển vi soi nổi, tiến hành làm tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi các đặc điểm hình dạng, màu sắc của sợi nấm, bào tử, đính bào đài, kích thước của bào tử bằng cách đo ngẫu nhiên 30 bào tử ở vật kính E10 và E40, lấy kích thước nhỏ nhất, lớn nhất và đường kính.
Thực hiện phương pháp ni cấy trên lam theo Wijedasa và Liyanapathirana (2012) để quan sát rõ đặc điểm của nấm và chụp hình.
- Phân lập, tách ròng: phân lập các loại nấm gây hại trên trái cà chua và tách ròng làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử hay đỉnh sinh trưởng sợi nấm theo phương pháp của Burgess và ctv. (2009). Quan sát sự phát triển của tản nấm trên môi trường PDA, ghi nhận lại các chỉ tiêu về màu sắc, cách mọc trên mơi trường, kích thước của tản nấm tại các thời điểm 3, 5, 7 và 9 ngày sau khi nuôi cấy. Bƣớc 3: Lây bệnh nhân tạo mầm bệnh đã đƣợc phân lập và quan sát lại
triệu chứng so với vết bệnh ban đầu.
Chuẩn bị trái cà chua sử dụng để lây bệnh: trái cà chua khơng bị bệnh, khơng q chín hay q xanh (lúc có màu vàng cam), trái trịn đều, khơng bị trầy xước hay biến dạng.
Phương pháp lây bệnh nhân tạo: Nguồn nấm được ni cấy trước đó trên đĩa Petri, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm sinh bào tử. Trái được nhúng vào cồn 70o trong 1 phút rồi lấy trái đặt dưới đèn cực tím trong 15 phút và để cho trái khơ tự nhiên. Chuẩn bị hộp nhựa chứa mẫu lây bệnh nhân tạo như sau: lót dưới đáy hộp 2- 3 lớp giấy thấm thanh trùng, nhỏ vào đó khoảng 3 ml nước cất thanh trùng giữ ẩm. Tiến hành lây bệnh bằng cách dùng kim tạo vết thương gần cuống trái, giữa trái và gần cuối trái, dùng ống nhỏ giọt hút khoảng 0,5 ml huyền phù bào tử nấm bệnh nhỏ lên vị trí đã tạo vết thương cho ướt đều. Đối với nấm Sclerorium sp. lây bệnh bằng cách đặt hạch nấm trưởng thành lên vị trí đã tạo vết thương. Riêng nấm
Stemphylium sp. chỉ tạo bào tử trên mô sống, trên mơi trường nhân chỉ có sợi nấm
thì lây bệnh bằng cách đặt sợi nấm trực tiếp tại vị trí tạo vết thương vào phần thịt trái. Đặt trái cà chua đã lây bênh nhân tạo vào hộp nhựa đã chuẩn, đậy nắp lại và ghi thông tin về ngày lây bệnh, loại nấm lây bệnh. Đặt hộp nhựa ở nhiệt độ 25oC, tránh ánh sáng mặt trời. Sau đó,theo dõi q trình xâm nhiễm của nấm gây bệnh, biểu hiện của vết bệnh, chụp hình lại tại các thời điểm 3,5 và 7 ngày, riêng đối với những lồi nấm có biểu hiện bệnh chậm thì theo dõi lâu hơn.
Bƣớc 4: Tái phân lập mầm bệnh từ vết bệnh đã lây bệnh nhân tạo và so
sánh với mầm bệnh ban đầu.
- Xác định chi nấm gây bệnh dựa vào khóa phân loại chi nấm của Barnett và Hunter (1998), Nguyễn Văn Bá (2005) và định danh đến tên loài dựa vào tài liệu của Rivka Barkai-Golan (2001), Watanabe (2002), Pitt và Hocking (2009).