2. Tổng quan vấn đề nghiên cứu
3.4 Phơng pháp nghiên cứu bệnh hại trong phòng
3.4.2 Phân lập và nuôi cấy nấm Colletotrichum gloeosporioides trên các
môi trờng nhân tạo
3.4.2.1 Phơng pháp để ẩm
Sau khi điều tra thu thập mẫu bệnh (lá, thân, cành, quả) ngồi đồng ruộng chúng tơi chọn mâu bệnh có triệu chứng điển hình rửa sách đất cát, cắt thành mẫu thích hợp để trong hơpk Petri có lót giấy ẩm, để ở nhiệt độ thích
hợp sau 2- 3 ngày có độ ẩm thờng xun, đem kiểm tra dới kính hiểm vi để xác định sơ bộ tác nhân gây bệnh.
3.4.2.2 Phơng pháp điều chế mơi trờng
Trong q trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng các loại môi trờng nhân tạo PDA, PCA, Czapeck, WA.
* Môi trờng PDA Thành phần
+ Khoai tây: 200gram
+ Agar: 20 gram
+ Đ ờng glucose: 20gram
+ Nớc cất: 1000 ml
Điều chế môi trờng: Khoai tây gọt sạch vỏ, thát lát mỏng, đem đun sôi
với nớc cất 30 phút, sau đó lọc bằng vải mỏng qua phễu. Nớc lọc cho thêm n- ớc cất đủ 1000 ml đem đun sôi lại.
Cho vào lần lợt, Agar khuấy đều cho tan hết, sau đó đổ mơi trờng vào bình tam giác, hay ống nghiệm có đậy nút giây bạc (Bình tam giác, ống nghiệm, hộp petri đã đợc rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1800C trong hai giờ). Sau đó đem khử trùng trong nồi hấp áp suất 1,5 atm (1210C) trong 30 phút.
Môi trờng đã khử trùng dùng để phân lập hoặc ni cấy nấm, có thể bảo quản trong tủ lạnh.
* Mơi trờng PCA Thành phần:
+ Khoai tây: 15gram + Agar: 20 gram + Cà rốt: 10gram + Nớc cất: 1000ml
Cách điều chế (1000ml): tơng tự nh môi trờng PDA * Môi trờng Czapeck
Thành phần + Saccarose: 20gram + NaNO3: 1gram + MgSO4: 0,5gram + FeCl3: 0,01 gram + KCl: 0,5 gram + Agar: 20gram + Nớc cất: 1000ml
Cách điều chế : Đong đủ 1000ml nớc cất đem đun sôi, rồi cho lần lợt các hoá chất đã đợc cân đủ lợng vào, khuấy đều cho tan hết, sau đó đổ mơi tr- ờng vào bình tam giác hay ống nghiệm có đậy nút gấy bạc (bình tam giác, ống nghiệm, hộp petri đã đợc rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1080C trong hai giờ). Rồi đem khử trùng trong nồi hấp, cách khử trùng tơng tự trong môi trờng PDA
* Môi trờng WA Thành phần:
+ Agar 20gram
+ Nớc cất: 1000ml
Cách điều chế : Đun tan Agar trong nớc cất sau đó khử trùng. Cách làm tơng tự các môi trờng trên.
3.4.2.3 Phơng pháp phân lập
Mẫu bệnh điển hình tơi mới ngồi đồng ruộng chúng tôi đem về phân lập và nuôi cấy trên các mơi trờng nhân tạo trong phịng thí nhiệm để tạo đợc nguồn nấm thuần khiết (Isolate) làm vật liệu nghiên cứu.
- Các phân lập mẫu bệnh:
+ Bệnh phân lập lấy từ các vết trên lá (thân, cành, quả) có triệu chứng điển hình cịn tơi mới đa về phịng thí nghiệm rửa sạch đất bụi bằng nớc máy. Dùng dao đã khử trùng miếng cắt (0,2 - 0,3) miếng cắt có phần mơ khoẻ và mơ bệnh sau đó khử trùng trong dung dịch HgCl2 0,1 % trong 1 phút tiếp tục
rửa sạch bằng nớc cất 2 đến 3 lần, rồi thấm khô bằng giấy lọc vô trùng. Dùng que cấy khử trùng (dùng cồn đốt lên ngọn lửa) để nguội cấy mô lên môi trờng nhân tạo.
Sau khi nấm mọc tiến hành cắt đầu sợi nấm cấy truyền sang các ống nghiệm khác từ 4 - 5 ống cho khi thu đợc nguồn nấm thuần khiết (Isolate). Quan sát đặc điểm hình thái, màu sắc sợi nấm. Khi đã có nấm, tản nấm và bào tử phân sinh, cành bào tử và các cấu trúc của nấm. Khi đã có nấm thuần khiết, tiến hành các thí nhiệm trong phịng.