2.4.3. Nghiên cứu vi khuẩn học
Mỗi răng trong nghiên cứu được làm xét nghiệm 3 lần. Lần 1 ngay sau mở tủy, lần 2 sau tạo hình và bơm rửa ống tủy. Lần 3 sau đặt thuốc calcium hydroxide. Các mẫu xét nghiệm mỗi lần đều đánh số lần 1, lần 2, lần 3 và ký hiệu cho mỗi răng và mỗi bệnh nhân.
2.4.3.1. Qui trình kỹ thuật *Bệnh phẩm
Dùng bấc (côn giấy vô trùng) đưa vào buồng tủy và ống tủy, sau đó lấy ra đưa vào eppendorf 1,5 ml vô trùng. Chuyển các eppendorf có chứa bấc bệnh phẩm đến Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương trong vòng 4 giờ. Bệnh phẩm được lấy theo đúng quy trình lấy mẫu như lấy bệnh phẩm để cấy hiếu khí và được vận chuyển bằng mơi trường chun dụng cho vi khuẩn kỵ khí.
2.4.3.2. Kỹ thuật tiến hành
* Ni cấy, phân lập, đánh giá số lượng vi khuẩn trong bệnh phẩm
- Chuẩn bị các chất xúc tác anotox, catalyst đặt vào trong máy VAC; + Cấy mẫu bệnh phẩm: Sử dụng pipette hút 50 µl dung dịch bảo quản bấc bệnh phẩm nhỏ lên bề mặt mơi trường thạch máu và socola kỵ khí, sử dụng đũa thủy tinh vơ trùng trải đều lượng dung dịch có chứa bệnh phẩm này trên toàn bộ bề mặt của đĩa thạch. Toàn bộ các bước đều được thực hiện trong tủ cấy kỵ khí.
Sau đó chuyển bình có đĩa BA và socola kỵ khí đã được cấy mẫu bệnh phẩm vào tủ ấm 37oC trong 48 giờ.
+ Sau khi có vi khuẩn mọc, đánh giá tính chất khuẩn lạc (hình thể, màu sắc, tan máu…)
+ Đếm số lượng từng loại khuẩn lạc để tính ra số lượng khuẩn lạc trong 1 đơn vị thể tích mơi trường bảo quản bệnh phẩm. Số lượng này tương đương với số lượng vi khuẩn trong côn giấy thấm dịch ở tủy răng.
+ Chọn 1 khuẩn lạc đại diện cho từng loại (trên mơi trường BA và socola kị khí) và cấy chuyển sang môi trường môi trường BA và socola kỵ khí khác. Sau đó nhuộm Gram để quan sát hình dạng vi khuẩn qua kính hiển vi; chụp ảnh hình thể vi khuẩn.
+ Tiến hành tăng sinh từng loại khuẩn lạc,