CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.3.Kỹ thuật định lượng hormon steroid bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khố
2.4. Các quy trình và kỹ thuật nghiên cứu
2.4.3.Kỹ thuật định lượng hormon steroid bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khố
phổ kép (LC-MS/MS).
2.4.3.1. Quy trình xử lý mẫu và phân tích hormon steroid trong huyết thanh
Sử dụng 200µl huyết thanh kết hợp với 1,0ml nước tinh khiết, sau đó bổ sung thêm 1 lượng chính xác các chất nội chuẩn, cụ thể là cortisol-2H4 1ng, DHEA-2H4 100pg, T-2H4 100pg, progesterone-13C3 100pg, estrone-13C3 100pg và estradiol-13C3 100pg/100ml.
Các mẫu huyết thanh được chiết xuất với 3ml ethyl acetate. Dịch chiết sau khi thu được sẽ cho vào cột lọc Bond Elut C18 (Varian, CA, USA) để loại bỏ tạp chất. Sau đó, lại dùng dung dịch acetonitrile 80% để tách các thành phần steroid ra khỏi cột lọc Bond Elut C18. Cho hỗn hợp các steroid thu được tác dụng với hỗn hợp picolinic anhydrid acid (gọi là thuốc thử A), thuốc thử này A sẽ phản ứng với nhóm hydroxyl của steroid để làm tăng sự nhạy cảm của các steroid với hệ thống LC-MS/MS [160], [161]. Hỗn hợp sau phản ứng sẽ tiếp tục đươc cho vào cột lọc InterSept pharm (GL science, Tokyo, Nhật Bản) để loại bỏ hóa chất dư thừa. Các dẫn xuất steroid của axit picolinoyl, và dẫn xuất không chứa picolinoyl được định lượng trực tiếp bằng hệ thống LC/MS-MS [160].
* Kiểm tra chất lượng và đánh giá kết quả
Các ion được ước tính như sau:
Cortisol và 2H4-cortisol: 468,2/309,2; 472,2/454,3; Cortison và 2H4-cortisol: 468,2/309,2; 472,2/454,3;
53
DHEA và 2H4-DHEA: 394,3/175,1; 398,1/179,4;
Androstenedion và 13C3- Androstenedion: 287,4/109,0; 290,1/100,1; Estron và 13C3-estron: 376,1/156,9; 380/160,8;
Estradiol và 13C3-estradiol: 483,3/264,0; 487,2/268,2.
Các giới hạn phân tích thấp nhất cho cortisol, cortison, DHEA, androstenedion, estron và estradiol tương ứng là 50, 50, 5, 10, 1,0 và 0,5 pg. Độ chính xác và độ lặp nằm trong khoảng ± 20% so với nồng độ thấp nhất trong ngày hay giữa các ngày. Độ chính xác và độ lặp lại cũng dao động trong khoảng ± 15% đối với các nồng độ khác.
2.4.3.2. Quy trình xử lý mẫu và phân tích hormon steroid trong nước bọt và sữa
* Tiến hành phân tích các steroid trong nước bọt và sữa bằng kỹ thuật LC-MS/MS
Mẫu nước bọt hoặc sữa (1.0ml – 1.5ml) được trộn với các chất nội chuẩn bao gồm cortisol-2H4 1ng, DHEA-2H4 100pg, T-2H4 100pg, progesteron- 13C3 100pg, estron-13C3 100pg và estradiol-13C3 100pg/100 ml. Hỗn hợp này được chiết xuất theo quy trình giống như đối với huyết thanh (hình 2.6).
Dịch chiết được cho vào cột Bond Elut C18 để tách các thành phần phân cực bao gồm cortisol và cortison bởi dung dịch acetonitrile 20% (2 ml) ra khỏi phần hỗn hợp, phần không phân cực được tách khỏi cột Bond Elut C18 bởi dung dịch acetonitrile 80% (3ml). Thành phần không phân cực lại tiếp tục được cho vào cột OASIS MAX (Massachusetts, Mỹ) đã được rửa trước bởi lần lượt các dung môi methanol (3ml), 0,1M NaOH (1ml) và nước (3ml).
Sau khi cho vào cột OASIS MAX, phần không phân cực sẽ được tách làm 2 phần. Phần trung tính được tách với methanol, còn estrogen (estradiol và estron) được tách bởi dung dịch 1% axit formic-methanol. Dung môi hữu cơ của cả hai phần được làm bay hơi hết. Phần estrogen được tạo dẫn xuất với hỗn hợp 2% pentafluorobenzyl bromide-acetonitrile (100μl) và dung dịch KOH-ethanol 5% (50μl) ở 530C, các dẫn xuất tạo thành của estradiol và
54
estron sẽ được tách bởi cột Intersept SI với dung dịch 15-50% ethyl acetate- hexan. Phần estron-3-pentafluorobenzyl được tạo thành dẫn xuất estron-3- pentafluorobenzyl-17-hydorazino-2-methylpiridinium theo phương pháp của Higashi [162], trong khi phần estradiol-3-pentafluorobenzyl được tạo thành dẫn xuất estradiol-3 pentafluorobenzyl-17-O-2-pyridinium ether bằng cách sử dụng tác nhân khác [163]. Cả hai dẫn xuất được tinh sạch trên một cột Bond Elut C18 để loại bỏ thuốc thử dư thừa. Các dẫn xuất của estron và estradiol được trộn với 100μl 1% axit formic/methanol/axetonitril (20: 1: 1) và 20 μl dung dịch này được đo bằng hệ thống LC-MS/MS.
Phần trung tính được xử lý theo phương pháp axit picolinic như đã mô tả ở trên cho các mẫu huyết thanh. Phần này cũng được đo bằng hệ thống LC- MS/MS (API 5000).
* Kiểm tra chất lượng và đánh giá kết quả
Các ion ước tính như sau: cortisol và 2H4-cortisol: 468,2/309,2; 472,2/454,3; cortison và 2H4-cortisol: 468,2/309,2; 472,2/454,3; DHEA và 2H4-DHEA: 394,3/175,1; 398,1/179,4; A-Dion và 13C3-A-Dione: 287,4 109,0; 290,1/100,1; estron và estron-13C3: 556,3/313,1; 560,3/379,3; estradiol và 13C3-estradiol: 544,2/339,0; 548,2/343,2.
Các giới hạn phân tích thấp nhất cho cortisol, cortison, DHEA, androstenedion, estron và estradiol tương ứng là 50, 50, 2, 10, 0,5 và 0,1 pg/khảo nghiệm. Độ chính xác và độ lặp lại đều nằm trong khoảng ± 20% so với mức giới hạn thấp nhất trong ngày và giữa các ngày xét nghiệm; và cả hai đều nằm trong khoảng ± 15% đối với nồng độ khơng phải thấp nhất.
55
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình phân tích hormon trong huyết thanh và nước bọt [164]