CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Dụng cụ
Thuốc sát trùng, săng vô trùng, túi vô trùng bảo vệ đầu dò, gel siêu âm, bơm tiêm 5 ml sử dụng một lần, ống đựng mẫu dịch ối.
Kim chọc ối là kim chọc dò tuỷ sống 27 Gauge
- Hệ thống giải trình tự gen Beckman CEQ-8000 (USA).
- Tủ lạnh sâu: -30°C; -80°C (SANYO), máy điện di: Mupid (Nhật Bản). - Máy quang phổ kế Thermo Electron Corporation của hãng Biomate. - Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm để bàn Eppendorf (Đức). - Lị vi sóng, tủ ấm, pipet, đầu cơn các loại.
- Eppendorf 1,5 ml, ống Falcol, cóng đo sạch.
2.2.2. Hóa chất
2.2.2.1. Hoá chất tách chiết DNA:
- Dung dịch lysis buffer, dung dịch K, dung dịch SDS 10%. - Proteinase K (10 mg/l).
- Dung dịch phenol: chloroform: isoamyl với tỷ lệ 25:24:1. - Dung dịch chloroform: isoamyl với tỷ lệ 24:1.
- Ethanol 100%, ethanol 70%, sodium acetate 3M, pH = 5,2.
2.2.2.2. Hoá chất chạy phản ứng MLPA
- SALSA MLPA Kit P034-A2 / P035-A2 DMD/Becker, hãng MRC – Holland, Amsterdam, Hà Lan.
- Bộ hóa chất chứa 80 đoạn dò (probe) cho 79 exon đích và exon DP427c, chia đều vào hai hỗn hợp probe P034 và P035.
- Thành phần hóa chất:
SALSA MLPA Buffer: KCl, Tris-HCl, EDTA, PEG-6000, pH 8,5
SALSA Ligase-65: Glycerol, BRIJ 0,05%, EDTA, KCl, Tris-HCl,
Beta-Mercaptoethanol 0.1%, pH 7,5, Ligase-65 enzyme (nguồn gốc vi khuẩn).
Ligase buffer B: Tris-HCl, non-ionic detergents, MgCl2, pH 8,5
SALSA PCR Primer Mix: oligonucleotides tổng hợp gắn huỳnh
quang Cy5, dNTPs, Tris-HCl, KCl, EDTA, BRIJ 0.04%, pH 8,0.
SALSA Polymerase: Glycerol, BRIJ 0,5%, EDTA, DTT 0,1%, KCl,
Tris-HCl, Polymerase enzym (nguồn gốc vi khuẩn), pH 7,5
Probemix: chứa oligonucleotides tổng hợp, oligonucleotides tinh
chế từ vi khuẩn, Tris-HCl, EDTA, pH 8,0.
- Bảo quản: hóa chất được bảo quản ở nhiệt độ -25oC đến -15oC, bảo quản trong hộp và tránh ánh sáng.
- Thành phần hỗn hợp probe (probemix):
Probemix P034-A2 chứa 45 probe khác nhau với sản phẩm khuếch đại có độ dài từ 129 đến 490nt và có 10 đoạn chứng tạo ra những sản phẩm khuếch đại có kích thước nhỏ hơn 120nt (có 2 probe đặc hiệu cho NST Y: 105-118 nucleotid).
Probemix P035-A2 chứa 45 probe khác nhau với sản phẩm khuếch đại có độ dài từ 129nt đến 490nt và có 9 đoạn chứng tạo ra những sản phẩm khuếch đại có kích thước nhỏ hơn 120nt (có 1 probe đặc hiệu cho NST Y gồm 105 nucleotid).
2.2.2.3. Hoá chất chạy phản ứng giải trình tự gen
BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) gồm BigDye Terminator v3.0 (dATP, dCTP, dGTP và dUTP), BigDye buffer, cặp mồi đặc hiệu, dung dịch formamide.
2.2.2.4. Hoá chất chạy phản ứng Microsatellite DNA
- Sample Loading Solution (SLS) (Beckman Coulter) - Size Standard 600 (Beckman Coulter)
Bảng 2.1. Các marker STR ứng dụng trong nghiên cứu