Phổ lưỡng sắc tròn (CD)

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.4. Phổ lưỡng sắc tròn (CD)

Phổ CD cho phép xác định cấu trúc tuyệt đối của các hợp chất phân lập từ tư nhiên có các trung tâm carbon bất đới, được đo trên máy Chirascan spectrometer (Applied Photophysics, Vương q́c Anh) tại Viện Hóa sinh biển, VAST.

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.2.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào và ức chế sinh trưởng tế bào ung thư

Hoạt tính gây đợc tế bào ung thư của các mẫu dịch chiết và các chất sạch được thưc hiện trên mợt sớ dịng tế bào ung thư: HepG2 (ung thư gan), SK-Mel-2 (ung thư da melanoma), MCF7 (ung thư vú) tại phịng Sinh học Thưc nghiệm, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Khả năng ức chế sinh trưởng tế bào ung thư trên các dòng tế bào HCT-15 (ung thư đại tràng), NUG-3 (ung thư dạ dày), NCI-H23 (ung thư phổi), ACHN (ung thư thận), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt), MDA-MB-231 (ung thư vú) được thưc hiện tại Phịng thí nghiệm hóa học các sản phẩm tư nhiên biển, Viện Khoa học và Cơng nghệ Đại dương Hàn Q́c, Busan, Hàn Q́c.

Hóa chất sử dụng:

- Đĩa 96 giếng nhưa (Corning, USA), pipette, eppendorf, máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-Rad), đầu đọc vi tấm VersaMax (LLC, Sunnyvale, CA, USA)

- Chất tham khảo: Ellipticine (Sigma, USA), adriamycin (Sigma, USA). - Các hóa chất thơng thường khác

- Các dịng tế bào ung thư do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia và American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) cung cấp.

 Nguyên lý của phép thử [56]:

Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sư phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thưc hiện theo phương pháp của Monks.

Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dưa vào mật độ quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thưc hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Các mẫu thử nghiệm được hòa tan trong DMSO và được chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau (0,5; 2; 10; 20 và 40 μM) bằng cách pha loãng tương ứng với mơi trường tăng trưởng

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật đợ cho phù hợp với thí nghiệm.

- Chất thử (10 L) đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm 190 L tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử trong giếng là 100 g/mL, 20 g/mL; 4 g/mL; 0,8 g/mL.

- Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng khơng có chất thử nhưng có TBUT (190 L) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cớ định bằng trichloracetic acid 50% (50 µg/mL) – TCA.

- Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB 0.4% trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid 1% rồi để khô ở nhiệt đợ phịng.

- Thuốc nhuộm liên kết với protein được chiết với base Tris 10 mM ở pH 10,5 để xác định mật độ quang học.

- Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy đọc ELISA (Bio-Rad) và đầu đọc vi tấm VersaMax.

- Phần trăm ức chế sư phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thơng qua công thức sau:

% ức chế = 100% -

[OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100 OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0) - Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác.

- Ellipticine ở các nồng độ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL được sử dụng như là chất đối chứng dương trong thử nghiệm gây độc tế bào; adriamycin được sử dụng làm chất đối chứng dương trong thử nghiệm ức chế sinh trưởng tế bào ung thư.

- DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế

50% sư phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4. - Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết được coi có hoạt tính tớt với IC50  20 μg/mL, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tớt (hit compound) khi IC50  5 μM [59].

Trong đó:

HighConc/LowConc: chất thử ở nồng đợ cao/chất thử ở nồng độ thấp HighInh%/LowInh%: % ức chế ở nồng đợ cao/% ức chế ở nồng đợ thấp

2.2.3.2. Hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO)

Hoạt tính ức chế sản sinh NO của các dịch chiết và các chất sạch được thưc hiện theo phương pháp của Griess trên đại thưc bào của chuột (RAW264.7 đối với các chất từ cây Na rừng (thưc hiện tại khoa Dược - Đại học Tôn Đức Thắng - Thành phớ Hồ Chí Minh và BV-2 với các chất từ cây Thông đất, thưc hiện tại Đại học Dược Wonkwang, Hàn Q́c) kích thích bởi LPS [57].

a. Nguyên lý chung:

Gớc tư do nitric oxide (•NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau. Khi xuất hiện các đáp ứng viêm, dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thưc bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thường được sản sinh với lượng lớn.

*Phương pháp gián tiếp để xác định •NO là xác định màu sắc của sản phẩm của nó (nitrate và nitrite). Trong phản ứng này, nitrate (NO3-) chuyển thành nitrite (NO2-), do tác động của nitrate reductase.

Khi xử lý với thuốc thử Griess, nitrite chuyển thành màu hồng theo phản ứng sau:

*Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả năng sớng sót của tế bào. Ở các tế bào sống, hệ enzym oxidoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan khơng hoà tan, màu tím đậm theo phương trình phản ứng sau:

Do vậy, tỉ lệ tế bào sớng sót được suy ra từ lượng formazan tạo thành từ MTT. Lượng formazan tạo thành được hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo đợ hấp thụ ở bước sóng 570 mm. Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm được suy ra từ việc đánh giá khả năng sớng sót của tế bào [61].

b. Phương pháp thực hiện

Tế bào (RAW264.7 hoặc BV-2) được nuôi cấy với nồng độ 5 x 105 tế bào/mL trong môi trường DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin G (100 U/mL), streptomycin (100 mg/L) và L-glutamine (2 mM). Sau đó, mơi trường được thay thế bằng môi trường mới chứa 100 g/mL LPS và các hợp chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau, giữ ổn định trong 24 h. Sư sản sinh NO được đánh giá dưa vào sư tích tụ nitrite trong dịch nổi của tế bào sử dụng thuốc thử Griess. Dung dịch DMSO 1% được sử dụng làm mẫu trắng, butein, dexamethasone, sulfuretin được sử dụng làm mẫu đối chứng [57].

NaNO2 ở các nồng độ khác nhau được sử dụng để xây dưng đường chuẩn. Độ hấp thụ được đo ở 570 nm.

Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính in vitro được bổ sung dung dịch MTT (0,5 mg/mL pha trong PBS), ủ 4 h ở 37oC và 5% CO2. Sau đó

hút bỏ hết mơi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hịa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ được đo ở 570 nm.

c. Tính tốn

- % ức chế NO

% ức chế = x 100 Trong đó:

A-C: nồng đợ NO2- (µM) A: LPS (+) mẫu (-) B: LPS (+) mẫu (+) C: LPS (-) mẫu (-)

Khả năng ức chế nitrite cho nồng độ ức chế trung bình IC50 – giá trị được tính toán bằng chương trình GraphPad Prism, version 8.4.0 (GraphPad Software Inc., USA)

- Tính giá trị CS % (% Cell Survival)

Giá trị CS: là khả năng sớng sót của tế bào ở nồng đợ ban đầu của mẫu thử, Giá trị CS (%) được tính theo cơng thức:

CS% = ± 

OD: mật đợ quang

σ: đợ lệch tiêu chuẩn được tính theo cơng thức:

Trong đó: xi: giá trị OD tại giếng i, : giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại

- Tính giá trị IC50

Nồng đợ ức chế 50%, IC50 được xây dưng trên 5 nồng độ thử nghiệm. Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 8.4.0.

% ức chế tế bào = x 100

Trong đó:

HighConc/LowConc: chất thử ở nồng đợ cao/chất thử ở nồng độ thấp HighInh%/LowInh%: % ức chế ở nồng độ cao/% ức chế ở nồng độ thấp.

2.2.3.3. Phương pháp xác định cấu hình đường bằng thủy phân acid

Quy trình thủy phân đường bằng acid để xác định cấu hình của đường được thưc hiện theo phương pháp đã công bố trước đây [58, 59, 60].

Hợp chất cần thử (1,0 mg) được thủy phân bằng cách đun nóng trong 100 μL dung dịch H2SO4 10% ở 80 °C trong 3 giờ, sau đó làm lạnh đến nhiệt đợ phịng và pha lỗng với 4 mL nước. Hỡn hợp sau phản ứng được trung hịa bằng BaCO3, và

lọc, sau đó dịch lọc được chiết bằng ethyl acetate (3 × 4 mL). Lớp nước được cơ đặc để thu được cặn đường, hịa tan cặn đường trong 1 mL pyridine và đun nóng với 6 mg L-cysteine methyl ester ở 60 oC trong 60 phút, sau đó thêm phenylisothiocyanate (0,1 mL) vào hỡn hợp phản ứng và tiếp tục phản ứng ở 60 oC trong 60 phút để tạo ra dẫn xuất arylthiocarbamate theo phản ứng sau:

0,7 mg sản phẩm được hịa tan trong acetonitrile và được phân tích bằng HPLC pha đảo tiêu chuẩn (Kinetex C18: 4,6 mm x 250 mm, 5 μm) với pha động là hỗn hợp 20% acetonitrile trong nước ở tớc đợ dịng 0,8 mL/phút, phát hiện bằng detector UV (ở 250 nm) ở điều kiện phân tích là 0 phút (80% nước/20% ACN) - 50 phút (20% nước/80% ACN). Các đường với cấu hình khác nhau sẽ cho sản phẩm có thời gian lưu khác nhau khi phân tích trên HPLC.

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Phân lập các hợp chất từ lồi Thơng đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic.Serm.) Serm.)

3.1.1. Quy trình phân lập các chất

Toàn cây Thông đất sau khi thu hái về được rửa sạch, phơi khô và nghiền nhỏ thu được 5,2 kg bột dược liệu khô. Lượng bột này được ngâm chiết với methanol ở nhiệt đợ phịng (3 lần x 10 L) trong 24 h. Dịch chiết methanol được đem đi cô quay thu được cặn chiết tổng (360 g). Cặn chiết này đem hịa vào 2 L nước và chiết phân bớ lần lượt với n-hexane, ethyl acetate và cô quay dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết n-hexane (H), cặn chiết ethyl acetate (E) và dịch chiết nước (W). Sơ đồ ngâm chiết được thể hiện trên hình 3.1.

Hình 3.1. Sơ đồ ngâm chiết thân cây Thơng đất

Dịch nước được phân tách trên cột Diaion HP-20 và rửa giải với hệ dung môi

MeOH/nước với tỷ lệ lần lượt là 100/1; 50/50 và 100/0) thu được 3 phân đoạn W1- 3.

Phân đoạn W2 (3,2 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP18 sử dụng hệ dung môi rửa giải là MeOH/nước (1/2 đến 2/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ (W2A-W2D).

Hợp chất LC1 (1,0 mg) thu được từ phân đoạn W2A tinh chế trên cột pha đảo RP18 hệ MeOH/acetone/H2O (8/1/1) và chạy qua cột Sephadex™ LH-20.

Phân đoạn W2C được chạy sắc ký cột pha thường với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/acetone/H2O (6/5/0,04/0,1) thu được 3 phân đoạn nhỏ W2C1- W2C3.

Hợp chất LC18 (3,0 mg) thu được bằng cách tinh chế phân đoạn W2C1 trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là EtOAc/MeOH/H2O (7/1/0,1) và qua cột SephadexTM LH-20 sử dụng hệ dung môi MeOH/H2O (1/1).

Tinh chế phân đoạn W2C3 (150 mg) trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi EtOAc/MeOH/H2O (7/1/0,1) và sắc ký cột pha đảo RP18 hệ dung môi MeOH/H2O (1/3 và 1/2) thu được hợp chất LC19 (4,0 mg) và LC20 (13,0 mg) và LC2 (4,0 mg). Phân đoạn W2D (640,0 mg) được tiến hành sắc ký cột pha thường hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/acetone/H2O (6,5/1/0,04/0,1) và cột Sephadex™ LH-20 rửa giải bằng hệ dung môi MeOH/acetone/H2O (8/1/1) thu được hợp chất LC3 (3,0 mg) và

LC4 (24,0 mg).

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập dịch nước của cây Thông đất

Cặn chiết Ethyl acetate (60 g) được tách thành 4 phân đoạn nhỏ E1-E4 bằng

cách sắc ký cột pha thường sử dụng hệ dung môi n-hexane/EtOAc (10/1 đến 0/1). Phân đoạn E3 (30 g) được tiến hành sắc ký cột pha thường hệ dung môi n-

hexane/EtOAc (20/1 đến 1/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ E3A-E3D.

Tinh chế phân đoạn E3B (7,0 g) trên cột sắc ký pha đảo RP18 hệ dung môi acetone/H2O (4/3) thu được hợp chất LC6 (2,5 mg) và LC12 (9,0 mg).

Phân đoạn E3C (14,0 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo hệ dung môi MeOH/H2O (1/1) và tinh chế thêm trên cột sắc ký pha thường hệ dung môi CH2Cl2/acetone (6/1) thu được các hợp chất LC5 (10,0 mg); LC7 (2,0 mg); LC8 (4,0 mg) và LC9 (5,0 mg);

Tinh chế phân đoạn E3D (2,8 g) trên cột sắc ký pha đảo RP18 hệ dung môi acetone/H2O (1/3) và tinh chế thêm trên cột silica gel pha thường hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (20/1) thu được hợp chất LC16 (10,0 mg) và LC17 (5,0 mg)

Tiến hành sắc ký cột pha thường phân đoạn E4 (15g) hệ dung môi n- hexane/EtOAc (6/1 đến 1/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ E4A-E4D.

Tinh chế phân đoạn E4A (1,4 g) trên sắc ký cột pha đảo RP18 hệ dung môi MeOH/H2O (8/1) và cột Sephadex™ LH-20 sử dụng hệ MeOH/H2O (1/1) thu được hợp chất LC10 (10,0 mg); LC11 (50,0 mg); LC13 (15,5 mg) và LC14 (5,0 mg).

Phân đoạn E4D (1,0 g) được tinh chế trên sắc ký cột pha đảo RP18 với hệ dung môi acetone/H2O và tiếp tục sắc ký cột pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (15/1) thu được hợp chất LC15 (6,0 mg).

Hình 3.3. Sơ đồ phân lập cặn EtOAc của cây Thông đất

3.1.2. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ lồi Thơng đất

3.1.2.1. Hợp chất LC1: Lycocernuaside E (hợp chất mới)

Chất bột màu trắng

HR-ESI-MS: m/z 559,1587 [M+Cl]−

KLPT chính xác (tính toán) [C25H32O12Cl]-:

559,1588 Cơng thức phân tử: C25H32O12, Mw = 524 g/mol

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.1

3.1.2.2. Hợp chất LC2: Lycocernuaside A

Chất bột màu trắng

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.2

3.1.2.3. Hợp chất LC3: Bombasin 4-O-β-D-glucopyranoside

Chất bột màu trắng

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.3

3.1.2.4. Hợp chất LC4: Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside glucopyranoside

Chất bột màu trắng

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.4

3.1.2.5. Hợp chất LC5: Cedrusin

3.1.2.6. Hợp chất LC6: Lycernuic B (hợp chất mới)

Chất bợt màu trắng

Góc quay cưc riêng: − 54.3 (c 0,04, MeOH) HR-ESI-MS: m/z 595,4002 [M-H]-

KLPT chính xác (tính toán) [C37H55O6]-: 595,4004 CTPT: C37H56O6 Mw = 596 g/mol

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.6

3.1.2.7. Hợp chất LC7: Lycocernuic ketone F (hợp chất mới)

Chất bợt màu trắng

Góc quay cưc riêng: − 31,6 (c 0,1; MeOH). HR-ESI-MS: m/z 473,3628 [M+H]+

KLPT chính xác (tính toán) [C30H49O4]+: 473,3625 CTPT: C30H48O4 Mw = 472 g/mol

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.7

3.1.2.8. Hợp chất LC8: Lycernuic ketone C

Chất rắn không màu

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng

4.1.8

3.1.2.9. Hợp chất LC9: Lycernuic ketone B

Dạng dầu không màu

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.9

3.1.2.10. Hợp chất LC10: Lycoclavanol

Chất bột màu trắng

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng 4.1.10

3.1.2.11. Hợp chất LC11: 3-epi-lycoclavanol

Chất bột màu trắng

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng

4.1.11

3.1.2.12. Hợp chất LC12: Methyl lycernuate B

Chất rắn không màu

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng

4.1.12

3.1.2.13. Hợp chất LC13: Lycernuic acid B

Chất rắn không màu

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng

4.1.13

3.1.2.14. Hợp chất LC14: 3β,21β,24-trihydroxyserrat-14-en-16-one

Chất bột màu trắng

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng 4.1.14

glucopyranoside

Chất bột màu vàng

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.15

3.1.2.16. Hợp chất LC16: Apigenin-4′-O-(6′′-O-p-coumaroyl)-β-D- glucopyranoside

Chất bột màu vàng

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng

4.1.16

3.1.2.17. Hợp chất LC17: Apigenin-4′-O-(2′′,6′′-di-O-trans-p-coumaroyl)-β-D- glucopyranoside

Chất bột màu vàng nhạt

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) xem Bảng

4.1.17

3.1.2.18. Hợp chất LC18: Cernuine

Chất bột màu trắng

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.18

3.1.2.19. Hợp chất LC19: Lycocernuine

Chất bột màu trắng

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD):xem Bảng 4.1.19

3.1.2.20. Hợp chất LC11: Cermizine C N-Oxide

Chất bột màu trắng

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.20

3.2. Phân lập các chất từ loài Na rừng (Kadsura coccinea (Lem.) A. C. Sm.)

3.2.1. Quy trình phân lập chất

3.2.1.1. Từ thân cây

Thân cây Na rừng sau khi thu hái về được rửa sạch, phơi khô, chặt và nghiền nhỏ thu được 5,5 kg bột khô. Bột này được chiết với methanol 80% (6 L x 3 lần) ở nhiệt đợ phịng trong 48 h. Dịch chiết methanol được cô quay dưới áp suất giảm thu được 320 g cặn chiết. Cặn chiết này được hòa vào 2 L nước và chiết phân bố lần lượt với

n-hexane (1 L x 3 lần), ethyl acetate (1 L x 3 lần), phần còn lại là nước. Các dịch

chiết tiến hành cô quay dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng, cặn H (78 g) và cặn E (165 g).

Phân đoạn ethyl acetate được sắc ký cột pha thường với chất hấp phụ silica gel, rửa giải bằng hệ CH2Cl2/MeOH (từ 0% đến 100%) thu được 12 phân đoạn nhỏ