, Nguyen Quy Hao1 Tran Ngo Hoang Dung1 Bui Thi Nhu Phuong2 Phan The Huy2 Dao Thanh Son 1*
QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM Bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm
Đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt quả bơ
Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết được đánh giá theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Sử dụng các chủng vi khuẩn E.Coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Pseudomonas. Sử dụng 2 nồng độ 20% và 40% đối chứng không sử dụng chiết. Dùng dụng cụ đục lỗ thạch có đường kính 6mm đục lỗ thạch. Nồng độ vi khuẩn được đo và lấy giá trị 108cfu. Để tủ ấm cho vi khuẩn mọc và đo đường kính vịng ức chế vi khuẩn xung quanh lỗ thạch, dựa vào đó để xác định đường kính vịng vơ khuẩn tạo ra và đánh giá mức độ kháng khuẩn của dịch chiết bằng công thức: BK (mm) = D – d Trong đó: D=đường kính vịng vơ khuẩn (mm), d=đường kính lỗ khoan thạch (mm).
Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết đến vi khuẩn hiếu khí có trong nước thải chăn ni
Tiến hành trộn chất chiết ở nồng độ 20% và 40% với mẫu nước thải chăn ni. Pha lỗng hỗn hợp trên theo cơ số 10. Vi khuẩn được nuôi cấy trên 2 môi trường thạch thường và thạch Macconkey, trong tủ ấm 37oC từ 24 – 48 giờ. Mẫu đối chứng không sử dụng dịch chiết.
Hình 1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả xác định thành phần hóa học có trong dịch chiết hạt quả bơ Bảng 1. Thành phần hóa học của dịch chiết methanol hạt quả bơ
STT Tên chất Công thức hóa học %
1 Phenylethyl alcolhol C8H10O 0.32
2 1,2-Propanediol, 3-methoxy- C4H10O3 0.35
3 1,2,3,5-Cyclohexanetetrol C6H12O4 8.09 4 3,7,11,15-Tetrametyl-2-hexadecen-1-ol C20H40O 2.44 5 Beta-Santalol C15H24O 0.49 Cao chiết Dung dịch chiết Hạt quả bơ Mẫu (dạng bột) Nghiền
Chiết Soxhlet n-hexan metanol etylaxetat
Lôi cuốn hơi nước
Dịch tối ưu Khảo sát tối ưu
Xác định thành phần hóa học
Đo GC/MS
Thử nghiệm trên mẫu PTN (vi sinh) Khuếch tán đĩa
Thử nghiệm trên mẫu (Nước thải) Đếm tổng số
VKHK
Đánh giá khả năng kháng khuẩn của hạt quả bơ và hiệu quả xử lý VKHK
6 17-Octadecen-14-yn-1-ol C12H20 3.95
7 n-Hexandecanoic acid C16H32O 3.81
8 17-Octadecen-14-yoic acid, methy ester C18H32O 2.28
9 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z) C18H34O 6.34
10 6,9-Octadecadienoic acid, metyl ester C19H34O2 0.56 11 11,14-Eicosatrienioc acid, methyl ester C21H38O2 1.32
12 3-Pyrroline, 1-nitroso- C4H6ON2 0.91
13 (Z)6-Pantadecen-1-ol C15H30O 0.19
14 Lauraldehyde, dimethyl acetal C14H30O2 0.18
15 Glaucyl alcohol C15H24O 0.26
16 (Z)6,(Z)9-Pentadecadien-1-ol C18H34O 0.18
17 1,4-Butanediol C4H10O2 0.12
18 Longifolenaldehyde C15H24O 9.67
19 17-Octadecene-9,11-diynoic acid, 8-
Hydroxy... C19H28O3 3.38
20 Pentadecanoic acid, 14-methyl-,metyl ester C17H34O2 0.27
21 8,11,14-Eicosatrienoic acid, (Z,Z,Z) C20H34O2 6.17
22 Squalene C30H50 12.12
23 Isocaryophyllene C15H24 0.08
24 1,3-Dicyclopentyl-2-n-dodecylcyclopentane C27H50 25.48
25 1H-Cyclopenta[1,3]cyclopropa[1,2]benzene... C15H24 0.12
26 Thành phần chưa định danh 10.92
Từ hạt quả bơ (Avocado seed) bằng phương pháp sắc khí khối phổ (GC/MS) đã tìm ra được 25 loại hợp chất có trong loại hạt này. Trong đó thành phần chiếm nhiều nhất là các loại acid béo.Có cả những cấu tử có độ phân cự yếu đến không phân cực, bao gồm các dẫn xuất của phenol, acid mạch dài 13C – 34C và ester của chúng.
Trong đó 1,3-Dicyclopentyl-2-n- dodecylcyclopentane chiếm tỷ lệ cao nhất (25.48%) và các acid thuộc họ acid Stearic như: Squalene (12.12%), 9,12- Octadecadienoic acid (Z,Z) chiếm 6.34%; 8,11,14-Eicosatrienoic acid, (Z,Z,Z) chiếm 6.17%.
Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn Bảng 2. Kết quả đo vịng vơ khuẩn trung bình đối với các chuẩn vi khuẩn khi xử lý
bằng dịch chiết hạt trái bơ
Dung dịch (Nghiệm thức) Thể tích 𝟏𝟎𝟎𝝁L/đĩa Bán kính vịng ức chế (mm)
E.Coli Salmonella Staphylococcus Pseudomonas
Dịch chiết 20% Mẫu Đối chứng 5.5556± 0.7a - 5.7711± 0. 7a - 7.7867± 0.7b - 5.7578± 0.7a - Dịch chiết 40% Mẫu Đối chứng 6.7156± 0.6ab - 7.2189± 0. 6b - 8.0411± 0.6c - 6.2267± 0.6a - Đánh giá khả năng kháng
Dung dịch chiết 20% có khả năng ức chế cả bốn loại vi khuẩn thử nghiệm ở thể tích là 100μL/đĩa. Ức chế hiệu quả sự sinh trưởng của vi khuẩn hiếu khí Staphylococcus aureus và chủng Salmonella (bán kính vịng vơ khuẩn tạo ra >7mm). Sự kháng khuẩn tạo ra sự đặc biệt có ý nghĩa lớn nhất đối với chủng Staphylococcus aureus, còn đối với các chủng cịn lại khơng tạo ra sự khác biệt lớn. Vịng kháng khuẩn lớn nhất có đường kính 8.67mm. Trung bình vịng kháng
khuẩn tạo ra đối với dịch chiết 20% là 7.78mm.
Dung dịch chiết 40% cho thấy có khả năng ức chế sự sinh trưởng của các vi khuẩn trên và đặc biệt ức chế mạnh hơn đối với dịch chiết 20%. Vòng kháng khuẩn lớn nhất có đường kính 8.67mm. Trung bình vịng kháng khuẩn tạo ra đối với dung dịch chiết 40% là 8.0411. Các thử nghiệm cho thấy dịch chiết 40% có khả năng kháng mạnh đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus.
Hình 2. Tác dụng kháng khuẩn Salmonella của dịch chiết hạt quả bơ 20% Kết quả thử nghiệm dịch chiết hạt quả bơ trong xử lý nước thải chăn nuôi
Bảng 3. Tác dụng của dịch chiết hạt quả bơ đến vi khuẩn có trong nước thải chăn nuôi
Thạch nuôi cấy Ký hiệu
dịch chiết
Nồng độ pha loãng mẫu
Số lượng khuẩn lạc trung bình có trong 1ml mẫu
nước thải (A) cfu/ml
Thạch thường N1 (20%) N2 (40%) 10-1 10-2 10-3 ĐC 10-1 10-2 10-3 ĐC 730 = 7.3x102 50x102 420 = 4.2x102 50x102 Thạch Macconkey N1 (20%) N2 (40%) 10-1 10-2 10-3 ĐC 10-1 10-2 10-3 ĐC 425 = 4.25x102 40x102 205 = 2.05x102 40x102
Hình 3. Vi khuẩn hiếu khí sau 24h ni cấy (sử dụng dịch chiết 20% và 40%)trên môi
trường thạch thường và macconkey Dung dịch chiết hạt trái bơ có tác dụng
kháng khuẩn tốt với vi khuẩn hiếu khí có trong nước thải chăn nuôi được lấy sau bể Biogas và qua hệ thống sàn lọc. Trong đó dịch chiết 40% có tác dụng mạnh nhất và
đạt được hiệu quả cao trên môi trường thạch Macconkey. Với số lượng vi khuẩn hiếu khí giảm đi đáng kể so với mẫu đối chứng (không sử dụng dịch chiết).
Hình 4. Hiệu suất xử lý vi khuẩn hiếu khí trên hai mơi trường thử nghiệm
Trên biểu đồ cho ta thấy rằng dịch chiết 40% có hiệu suất cao hơn dịch chiết 20% và môi trường nuôi cấy trên thạch Macconkey có hiệu quả cao hơn thạch thường. Hiệu suất xử lý cao nhất đối với dịch chiết 40% đạt được 94.875%. Như vậy, có thế kết luận rằng dịch chiết hạt quả bơ có khả năng kháng vi khuẩn hiếu khí trên tất cả các mơi trường thử nghiệm và đều cho hiệu suất tương đối cao H>80%.
KẾT LUẬN
Bằng phương pháp chiết soxhlet với ba loại dung môi trong các khung giờ thời gian đã cho thấy rằng với dung môi
methanol ta thu được dung dịch chiết hạt quả bơ là cao nhất và chiết trong khoảng thời gian 6 giờ thì hiệu suất đạt cao nhất so với hai loại dung môi là n-hexan và etyl axetat và khối lượng dịch thu được tối ưu là 1.665 g/100g chất khô.
Hơn 25 hợp chất được tìm thấy trong đó thành phần chính là các hợp chất của các axit béo và dẫn suất của hợp chất Flavonol (thuộc nhóm phenol phức tạp).
Trong thí nghiệm xác định khả năng kháng khuẩn, cho thấy dịch chiết hạt quả bơ 20% và 40% đều có khả năng kháng các chủng vi khuẩn: E.Coli, salmonella, Stephylococcus aureus và Pseudomonas. Trong đó dịch
85.4 91.6 89.375 94.875 75 80 85 90 95 100 20% 40% H iệu suất tt hu đ ượ c % dịch chiết
Biểu đồ so sánh hiệu quả % dịch chiết và môi trường nuôi cấy
Hiệu suất trên Thạch thường Hiệu suất trên Thạch Macconkey
chiết 40% kháng mạnh hơn dịch chiết 20% và kháng mạnh nhất đối với vi khuẩn Stephylococcus. Đường kính vịng vơ khuẩn tạo ra lớn nhất là 8.67mm cho thấy dung dịch chất chiết hạt quả bơ có chứa thành phần các acid có khả năng kìm hãm sự phát triển của các loại vi khuẩn.
Dung dịch chiết hạt quả bơ có tác dụng kháng khuẩn tốt với vi khuẩn hiếu khí trong nước thải chăn nuôi sau hầm Biogas.
Với phương pháp xử lý nước thải chăn nuôi bằng dung dịch chiết hạt quả bơ đã cho kết quả thấy rằng dung dịch chiết 40% có khả năng xử lý hiệu quả tốt hơn dung dịch chiết 20% và tác dụng tốt hơn khi được nuôi cấy trên môi trường là thạch macconkey. Số lượng vi khuẩn hiếu khí đã giảm đi rõ rệt (giảm đi từ 10 – 20 so với các mẫu đối chứng (không sử dụng dịch chiết hạt quả bơ).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ĐÀM TUẤN TÚ (2010). Thực trạng ô nhiễm môi trường và xử lý chất thải trong chăn
nuôi lợn trang trại tập trung. Tạp chí Khoa học và Cơng nghệ Chăn nuôi, số 23,
trang 55-62.
NGUYỄN VĂN THỌ (2003). Sự phân tán và khả năng phát triển của một số trứng giun, sán lợn qua hệ thống Biogas. Khoa học Kỹ thuật Thú y, số 3, trang 22-27.
TRỊNH QUANG TUYÊN, NGUYỄN QUẾ CƠI, NGUYỄN THỊ BÌNH, NGUYỄN TIẾN THƠNG VÀ NGUYỄN VĂN ĐỨC (2002). Phương Pháp kiểm tra thống kê sinh học. Khoa học Kỹ thuật.
VŨ ĐÌNH TƠN, LẠI THỊ CÚC, NGUYỄN VĂN DUY, ĐẶNG VŨ BÌNH (2008). Chất
lượng nước dùng trong trang trại chăn nuôi lợn vùng đồng bằng Sông Hồng. Tạp
chí Khoa học và Phát triển – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, tập 6, số 3, trản 279 – 283.