Sơ đồ phản ứng xúc tác enzym trường hợp có 1 chất nền

Phức ES gọi là phức Michaelis- Menten.

Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES.

Gọi v-1 là vận tốc của phản ứng phân ly phức chất ES tạo thành E và S. Gọi v2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm).

v1 = k1[E][S] v-1 = k-1[ES] v2 = k2[ES] Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có:

k-1[ES] + k2[ES] = k1[E][S] (1)

Gọi Eo là nồng độ enzym ban đầu, [E] là nồng độ enzym tự do: [Eo] = [E] + [ES] => [E] = [Eo] - [ES] (3) Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có:

(k-1 + k2)[ES] = k1([Eo] - [ES])[S] Nếu đặt Km=

k 1Ệ k 2

(K : gọi là hằng số Michalis Menten) thì:

k1

[ES ]  [ Eo ][S ]

K m  [S ]

Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P: Vo = k2[ES]

(với Vo là vận tốc đầu của phản ứng mà lúc nồng độ sản phẩm chưa đáng kể và sự tạo thành ES từ sản phẩm (E+P) có thể bỏ qua).

Thay [ES] bằng giá trị ở trên ta thu được:

V  k 2 [ Eo ][ S ]

K m  [S ]

(4)

Qua đây ta thấy nồng độ enzym càng cao thì vận tốc phản ứng enzym càng lớn. Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzym liên kết với chất nền, nghĩa là:

Vmax= k2[Eo] (5)

(với Vmax là vận tốc phản ứng cực đại khi toàn bộ khi toàn bộ E kết hợp với S tạo thành phức ES).

Thay (5) vào phương trình (4) ta được:

Vo  Vmax

K

[S ]

m  [S ] (*)

Phương trình (*) gọi là phương trình Michaelis Menten.

Km là hằng số Michaelis đặc trưng cho mỗi enzym, đặc trưng cho cho ái lực của enzym với chất nền, Km càng nhỏ thì ái lực của chất nền với enzym càng lớn, tốc độ phản ứng càng cao vì vận tốc cực đại Vmax đạt ở giá trị nồng độ chất nền càng thấp.

Ý nghĩa thực tiễn của hằng số Michaelis là ở chỗ nó chính là giá trị của nồng độ chất nền khi tốc độ phản ứng bằng ½ tốc độ tối đa. Thay Vmax và Vo bằng các

m

con số tương ứng 1 và 0,5 vào phương trình trên, ta sẽ thấy rõ điều đó. Như vậy, Km được đo bằng đơn vị nồng độ, tức mol/l.

Trên cơ sở phương trình Michaelis-Menten, bằng cách xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc của vo vào [S] và bằng đồ thị đó xác định tốc độ tối đa Vmax ta có thể tìm thấy giá trị của [S], ở đó Vo = Vmax/2, tức giá trị của Km (Hình 1.3).

Hình 1.3: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất nền.

Khi tăng [S] thì vận tốc phản ứng v tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì v đạt đến giá trị Vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S]. Khi Km = [S] thì Vo = 1/2 Vmax

Năm 1934, Lineweaver và Burk, trên cơ sở của phương trình (5) đã nghịch đảo để biến thành dạng đường thẳng y = ax+b, nó có ý nghĩa lớn đối với việc nghiên cứu ức hãm enzym. Phương trình (*) sẽ trở thành:

1  K m Vo Vmax 1 [S ]  1 Vmax (**)

Phương trình này gọi là phương trình Lineweaver - Burk

2.3.3. Ảnh hưởng của chất ức chế

Chất ức chế là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzym khơng cịn khả năng xúc tác biến chất nền thành sản phẩm.

2.3.3.1. Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)

Trong trường hợp ức chế cạnh tranh, chất nền và chất ức chế cạnh tranh nhau để tác dụng lên trung tâm hoạt động của enzym.

Hình 1.5: Kiểu ức chế cạnh tranh

Phương trình Michealis-Menton cho kiểu ức chế cạnh tranh:

Vo 

Vmax [S ]

K m  K ct [S ] (6)

=> Phương trình Lineweaverr- Burk khi có chất ức chế cạnh tranh:

1

 K ct

Vo Vmax[S ]1  V1 max

(7)

Với Kct là hằng số cân bằng của kiểu ức chế cạnh tranh.

Dựa vào phương trình (7) ta thấy: nếu nồng độ chất nền dư thừa, nồng độ chất ức chế thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất ức chế, còn nồng độ chất nền thấp và nồng độ chất ức chế cao thì lại có tác dụng ức chế hồn tồn.

Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaverr- Burk khi có chất ức chế cạnh tranh.

Hình 1.6: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver- Burk khi có ức chế cạnh tranh

Kiểu ức chế này cho thấy đường thẳng có nồng độ chất ức chế càng cao thì có độ xiên lớn hơn và các đường thẳng cùng cắt trục tung ở một điểm là 1/Vmax

Người ta thấy ức chế như vậy phần lớn giữa chất ức chế và chất nền có sự tương đồng về mặt hóa học. Ví dụ: acid malic có cấu trúc gần giống với acid

succinic nên ức chế cạnh tranh enzym succinatdehydrogenase, là enzym xúc tác cho sự biến đổi acid succinic thành acid fumaric.

Trường hợp đặc biệt của ức chế cạnh tranh là ức chế bằng sản phẩm. Trường hợp này xảy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzym và chốn vị trí hoạt động ở phân tử enzym.

Xác định Ki của kiểu ức chế cạnh tranh

Đối với kiểu ức chế cạnh tranh, ta có: K ct  K m [1  [I ]] hay: K K ct  K m K i i [ I ]  K m

Lập đồ thị Kct theo [I], vẽ đường thẳng biểu diễn Kct theo [I] sẽ cắt trục hoành tại - Ki (khi Kct = 0) (Hình 1.7).

Hình 1.7: Đồ thị biểu diễn Kct theo [I] khi có chất ức chế cạnh tranh để xác định Ki.

2.3.3.2. Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition)

Đặc trưng của kiểu ức chế này là chất ức chế chỉ liên kết với phức hợp ES, mà khơng liên kết với enzym tự do.

Hình 1.8: Kiểu ức chế kháng cạnh tranh.

Phương trình Michealis-Menton cho kiểu ức chế kháng cạnh tranh:

Vo 

Vkct [ S ]

(8)

K kct [ S ]

Phương trình Lineweaver-Burk khi có chất ức chế kháng cạnh tranh:

1  K kct  Vo Vkct 1 [S ] 1 Vkct (9)

Với Kkct là hằng số ức chế theo kiểu kháng cạnh tranh. Vkct là vận tốc phản ứng khảo sát của phương trình.

Trong trường hợp này ta thấy khi E kết hợp với S làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzym và tạo trung tâm kết hợp với I, do đó khơng thể loại bỏ tác dụng ức chế bằng cách tăng nồng độ chất nền.

Hình 1.9: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver- Burk khi có ức chế kháng cạnh tranh

Kiểu ức chế này cho thấy các đường thẳng có độ nghiêng bằng nhau, song song với nhau khơng hội tụ tại một điểm.

Xác định Ki kiểu ức chế kháng cạnh tranh Ta có Vkct  V ; 1  [I ] K i K kct  K m 1  [I ] K i Do đó 1 Vkct  1 Vmax  [I ]  K i 1 Vmax và 1 K kct  1  [I ]  1 K m Ki K m

Để xác định Ki, lập đồ thị 1/Vkct hoặc 1/Kkct theo [I], đường biểu diễn sẽ cắt trục hồnh ở điểm –Ki (Hình 1.10)

a) b)

Hình 1.10: Đồ thị biểu diễn 1/Vkct (a) và 1/Kkct (b) theo [I] khi có chất ức chế kháng cạnh tranh để xác định Ki

2.3.3.3. Ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibitor)

Ức chế không cạnh tranh là kiểu ức chế mà enzym có thể kết hợp với hoặc chất ức chế, hoặc chất nền, hoặc cả hai.

Hình 1.11: Kiểu ức chế khơng cạnh tranh

Phương trình Michealis-Menton cho kiểu ức chế khơng cạnh tranh:

Vo  Vkoct [ S ] (10)

Phương trình Lineweaver-Burk khi có chất ức chế khơng cạnh tranh: 1  K m Vo Vkoct [S ]1  V1 koct (11)

Với Kkoct là hằng số ức chế của kiểu ức chế khơng cạnh tranh.

Hình 1.12: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver- Burk khi có ức chế khơng cạnh tranh

Kiểu ức chế này cho thấy các đường thẳng càng có nồng độ chất ức chế càng cao thì có độ xiên lớn hơn và các đường thẳng cùng hội tụ tại một điểm 1/Km nằm trên trục hoành.

Xác định Ki kiểu ức chế khơng cạnh tranh

Vmax Ta có Vkoct  1  [I ] K i Do đó 1 Vkoct  1 Vmax  [I ]  K i 1 Vmax

Để xác định Ki, lập đồ thị 1/Vkoct theo [I], đường thẳng biểu diễn sẽ cắt trục hồnh ở điểm –Ki (Hình 1.13)

Hình 1.13: Đồ thị biểu diễn 1/Vkoct theo [I] khi có chất ức chế không cạnh tranh để xác định Ki

2.3.3.4. Ức chế hỗn tạp (mixed inhibition)

Ức chế hỗn tạp là kiểu ức chế mà chất ức chế không những liên kết với enzym tự do mà còn liên kết với cả phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo được sản phẩm P. Hiện tượng ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế. Tốc độ cực đại đo được khi khơng có mặt chất ức chế là cao hơn khi có mặt chất ức chế. Giá trị Km thay đổi không giống như trong trường hợp ức chế cạnh tranh.

Phương trình Michealis-Menton cho kiểu ức chế hỗn tạp:

V o  V ht [ S ] (12)  1  [ I ]   K si [ S ]

Với K    K i (K là hằng số cân bằng tạo thành ESI)

ht Vht   1   V si [I ]   si   1   [I ]   si 

Phương trình Lineweaver-Burk cho kiểu ức chế hỗn tạp:

1  K ht  Vo Vht 1 [S ] 1 Vht (13) K K

K K  [I ]  Tương quan giữa Kht và Vht là: ht

Vht  m

1  

Vmax  i 

Lập đồ thị 1/V0 theo 1/[S] của phương trình (13), đường biểu diễn khi có chất ức chế sẽ cắt đường biểu diễn khi khơng có I khơng nằm trên trục tung cũng không nằm trên trục hồnh. (Hình 1.14)

Hình 1.14: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver- Burk khi có ức chế hỗn tạp

Kiểu ức chế này cho thấy các đường thẳng càng có nồng độ chất ức chế càng cao thì có độ xiên lớn hơn và các đường thẳng cùng hội tụ tại một điểm không nằm trên trục tung. Xác định Ki của kiểu ức chế hỗn tạp Ta có: K ht  K m  1 [I ]  hay K ht  K m [ I ]  K m Vht Vmax  K i  Vht Vmax .K i Vmax

Để xác định Ki, lập đồ thị Kht/Vht theo [I], đường biểu diễn sẽ cắt trục hoành ở điểm –Ki (Hình 1.15)

Hình 1.15: Đồ thị biểu diễn Kht/Vht theo [I] khi có chất ức chế hỗn tạp để xác định Ki

Bảng 1.1: Tóm tắt ảnh hưởng của kiểu ức chế lên Vmax và Km.

Kiểu ức chế Cạnh tranh Kháng cạnh tranh Hỗn tạp Không cạnh tranh

Vmax Không ảnh hưởng Giảm Giảm Giảm

Km Tăng Giảm Tăng Không ảnh hưởng

2.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ [2]

Ta có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ của môi trường, hiện tượng này tuân theo định luật Vant-Hoff. Điều này có nghĩa là khi tăng nhiệt độ lên 10 lần thì tốc độ phản ứng tăng lên khoảng 1,5 đến 2 lần. Đối với phản ứng do enzym xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng chỉ trong một phạm vi nhất định, vì bản chất enzym là protein. Khi ta tăng nhiệt độ lên trên 40-50oC xảy ra quá trình phá hủy chất xúc tác. Mỗi enzym có một nhiệt độ tối ưu khác nhau. Sau nhiệt độ tối ưu thì tốc độ phản ứng enzym xúc tác sẽ giảm.

2.3.5. Ảnh hưởng của pH [2]

Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết chất nền và hoạt động của phân tử enzym, dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH.

Đa phần các enzym bền trong khoảng 5 < pH < 9, nhiều enzym hoạt động rất mạnh ở mơi trường pH trung tính và cũng có rất nhiều enzym hoạt động mạnh ở cả pH kiềm và trung tính.

Bản chất hóa học của thành phần dung dịch đệm cũng ảnh hưởng đến độ bền, hoạt động xúc tác của enzym.

Tóm lại, ngồi các yếu tố đã nói ở trên, cịn có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng lên hoạt động xúc tác của enzym như: ánh sáng, chất hoạt hóa, sóng siêu âm, sự chiếu điện…

2.4. Giới thiệu về enzym α-glucosidase

Enzym α-glucosidase với những tên khác như maltase, glucoinvertase, glucosidoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, nitrophenyl α-D- glucosidase, transglucosidase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D- glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzym xúc tác các phản ứng thủy phân).

Khi thức ăn được hấp thụ vào cơ thể thì các carbohydrat trong thức ăn được thủy phân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzym trong ruột non. Tiến trình phân hóa này địi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzym α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid. Enzym α-glucosidase ở màng ruột non lại tiếp tục phân hoá các oligosaccharid thành các phân tử đường nhỏ hơn nữa rồi mới thẩm thấu vào máu. Bằng cách kiềm chế hoạt động của enzym α- glucosidase có thể làm giảm sự thủy giải của carbohydrat và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào mạch máu. [29]

α-amylase Tinh bột Saccharose (Glucose + Fructose) Maltose (Glucose + Glucose) Chất ức chế α-glucosidase Chất ức chế

Glucose Glucose Glucose Fructose

Glucose huyết tăng