2.5. Tác nhân ức chế enzym -glucosidase
Việc tìm kiếm các hợp chất ức chế enzym -glucosidase có ý nghĩa rất lớn trong các lĩnh vực như dược phẩm, thực phẩm… Đã có rất nhiều hợp chất được tìm thấy trong tự nhiên hoặc tổng hợp có khả năng ức chế enzym α-glucosidase. Tuy
nhiên, những tác nhân ức chế enzym -glucosidase hiện nay thường gây nhiều
phản ứng phụ. Vì vậy, việc tìm kiếm các hoạt chất có khả năng ức chế enzym
-glucosidase vẫn đang được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới.
Thông thường, việc nghiên cứu các hoạt chất ức chế -glucosidase ln bắt đầu từ các hợp chất có trong tự nhiên vì nguồn dược thảo rất phong phú, đa dạng và ít phản ứng phụ. Do đó, các nhà khoa học trên thế giới thường sử dụng những phương pháp sàng lọc hoạt tính ức chế enzym này để định hướng trong nghiên cứu. Nhiều nước đã cơng bố trên các tạp chí quốc tế về các cây thuốc có khả năng ức chế enzym - glucosidase với mục đích sử dụng trong lĩnh vực dược phẩm, cũng như đã cơ lập được nhiều hợp chất có hoạt tính ức chế enzym -glucosidase từ nguồn dược thảo.
Hiện nay, các hợp chất ức chế enzym -glucosidase được chia thành
các nhóm chính sau: disacccarit, iminosugar, thiosugar, pseudoaminosugar, carbasugar và các hợp chất khơng có liên kết glucosidic. Dưới đây liệt kê một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase.
2.5.1. Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase từ tổng hợp [27]
Disaccarit
Nijibiose
Iminosugar
3-O-(-D-Glucopyranozyl)-1-deoxynojirimycin
Isofagomin Noeuromycin
Hình 1.17: Các hợp chất iminosugar ức chế enzym α-glucosidase
Carbasugar và pseudoaminosugar
Voglibose
Hình 1.18: Các hợp chất carbasugar và pseudoaminosugar ức chế enzym α-glucosidase
Thiosugar
X = O; S; Se; N Tetrahydroxyazepan
Hình 1.19: Các hợp chất thiosugar ức chế enzym α-glucosidase
R R1 đến R4 (CH2)Ph Cl Ph R H N-p-coumaroyl-N'-feruloyputrescin CH3 N, N'-diferuloyputrescin
Hình 1.20: Các hợp chất khơng có liên kết glycosidic ức chế enzym α-glucosidase
2.5.2. Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase cô lập tự nhiên [27]
Disaccarit
Kojibiose được cô lập từ dịch chiết xa kê năm 1953 bởi Ugalde, Staneloni, Leloir và các cộng sự có hoạt tính ức chế enzym-glucosidase. Kojibiose có nối
-(12) glycosidic được cô lập ra từ Aspergillus oryzae.
Dịch chiết từ hạt Mormodica charantia và từ trái Grifola frondosa cho hoạt tính ức chế -glucosidase và cô lập được D-(+)-trehalose. Trehalose có 2
monosaccarit liên kết với nhau bởi nối -(11) và là chất gây nên hoạt tính đó.
Trehalose Iminosugar
Hợp chất -homonojirimycin được Kite cùng các cộng sự cô lập từ lá cây
Omphalea diandra và Aglaonema treubii có hoạt tính kháng enzym -glucosidase.
-Homonojirimycin
Từ dịch chiết bằng MeOH của cây Lobelia sessifola cô lập được hợp chất
7-O-(β-D-glucopyranozyl)--homonojirimycin. Hợp chất này có hệ thống polyhydroxy piridin kết nối với đường bằng cầu oxy-metilen. Hợp chất này có hoạt tính kháng enzym -glucosidase mạnh.
Khi nghiên cứu cây Adenophora spp., một cây cùng chi với cây Lobelia sessifola, người ta cô lập từ rễ cây này một số hợp chất polyhydroxylat alkaloid có
khả năng kháng enzym -glucosidase.
Adenophorin 5-Deoxyadenophorin
Từ cây Angylocalyx boutiquenus, ta cô lập được hợp chất 1,4-dideoxy-1,4-
imino-D-arabinitol (DAB-1) có hoạt ức chế enzyme -glucosidase và được xem là
một tác nhân mới trong việc điều trị tiểu đường loại 2.
1,4-Dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol
Sự liên kết của vòng piperidin và pyrolidin tạo thành nhóm các hợp chất indolizidin. Trong đó, hợp chất (-)-swainsonin được cô lập từ cây Swainsona canescens, Astragalus lentiginosus, Ipomoea carnea và hợp chất castanospermin được cô lập từ dịch chiết hạt cây Castanospermum austral là những hợp chất alkaloid có khả năng ức chế enzym -glucosidase mạnh.
Carbasugar và pseudoaminosugar
Năm 1908, Kuble đã cô lập được hợp chất conduritol A từ vỏ của quả nho
Marsdenia condurango, một hợp chất có khả năng ức chế enzym α-glucosidase.
Hợp chất này cũng được tìm thấy trong cây Glymnena sylvestre, một loài cây bụi được dùng làm thuốc trị bệnh đái tháo đường ở một số nước châu Á và Ấn Độ.
Conduritol A Thiosugar
Yoshikawa và các cộng sự đã cô lập được từ dịch chiết nước của rễ và thân cây Salacia reticulata Wight một hợp chất có khả năng ức chế -glucosidase
mạnh. Hoạt tính của nó thì cao hơn hợp chất acarbose, hợp chất thường được sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường.
Salacinol
Katalanol, một dẫn xuất của 1,2,3-trihydroxypropylsalacinol được cô lập từ cây Salacia reticulate có hoạt tính ức chế enzym -glucosidase mạnh hơn
Kotalanol Hợp chất khơng có liên kết glycosidic
Từ cây Streptomyces melanosporofaciens, người ta đã cô lập được hợp chất dibutyl phtalat. Hợp chất này có khả năng ức chế enzym -glucosidase kiểu không cạnh tranh.
Dibutyl phtalat
Năm 2006, Nilubon Jong-Anurakkun và cộng sự đã cô lập được 2 hợp chất (-)-lyoniresinol 3a-O-β-D-glucopyranosid và quercetin 3-O-β-D- xylopyranosyl(1’’2’’)-β-D-galactopyranosid có hoạt tính ức chế enzym α-
glucosidase từ lá cây Alstonia scholaris. [8]
Quercetin 3-O-β-D-xylopyranosyl(12)-β-D-galactopyranosid
3. TỔNG QUAN VỀ CÂY NÚC NÁC 3.1. Tên gọi
Cây núc nác có những tên khoa học như: Oroxylum indicum (L.) Kurz,
Oroxylum indicum (L.) Vent, Bignonia indica L., Oroxylon indicum Vent,
Calosanthes indica (L.) Blume, Oroxylum indicum (L.) Benth.ex Kurz). [1] [3] [6]
Ngoài ra, núc nác cịn có nhiều tên gọi khác: mu hu die (Trung Quốc); midnight horror, shyonaka, sonpatha, indian trumpet flower, broken bones, midday marvel (Anh); oroxyle, calosanthe (Pháp); bungli, kajeng jaler, kayu lanang, mungli, wungli (Nhật); ungca (Lào); kulai, merkulai, merulia, merlai, bonglai kayu, bolai kayu, boli, boloi, bongloi, berak, beka, beka kampung, bikir, bikir hanglap, kantatang, misai kucing, kulai (Malaysia); tatelo, karamkanda, saune tatal (Nepan); pong-porang (Sudan); Kapung-kapung (Sumantran); achi, vanga adanthay (Tamil); Pheka, Sang Mak (Thái Lan). [1] [3] [6] [16]
Ở Việt Nam núc nác còn được gọi là so đo thuyền, nam hoàng bá, mộc hồ điệp, ngọc hồ điệp, vân cố chỉ, bạch ngọc chỉ, thiêu tầng chỉ, mạy ca, phắc ca (Tày), co ca liên (Thái), p`sờ lụng (K`ho), kờ lúc (K`dong), póc ta lốp (Ba Na), ngòng pắng điẳng (Dao).[1] [3] [6]
Giới Plantae Ngành Magnoliophyta Lớp Magnoliopsida Bộ Lamiales Họ Bignoniaceae Chi Oroxylum
Lồi Oroxylum indicum
3.2. Mơ tả thực vật [1] [3] [6]
Cây nhỡ, có kích cỡ từ nhỏ đến trung bình từ 5-13m. Thân hình trụ nhẵn, ít phân nhánh; vỏ cây dày, màu xám tro và có nhiều sẹo to do lá rụng để lại, mặt trong có màu vàng nhạt.
Lá kép lông chim, mọc đối, dài đến 1,5m, thường tập trung ở ngọn thân, phiến xẻ 2-3 lần lơng chim. Lá chét hình bầu dục, ngun, dài 6-14cm, rộng 3,5-8 cm, gốc tròn hơi lệch, đầu nhọn. Mặt trên lá sẫm bóng, mặt dưới nhẵn hoặc có ít lơng, cuống lá kép hình trụ, có các chấm bì khổng.
Cụm hoa có cuống mập và thẳng, mọc ở ngọn, thành chùm dài 40-80 cm, mang nhiều sẹo ở phía dưới, lá bắc nhỏ. Hoa to, màu nâu đỏ sẫm, đài hình chng, lá đài dày và ngắn, dài 2,5 cm, ống tràng hình phễu, dài 9 cm, hơi phình ở họng, 5 cánh hoa chia thành 2 môi, cong gập xuống, mép nhăn nheo. Nhị 4 cái đều và 1 cái hơi ngắn hơn, chỉ nhị có lơng mịn ở gốc, bầu thuôn dài. Hoa nở về đêm, thụ phấn nhờ dơi và gió. Mùa hoa: tháng 6-8.
Hình 1.21: Cây núc nác và hoa
Quả cong, thõng đu đưa từ nhánh như cái liềm, quả nang, dẹt và cong, dài 50-80 cm, dày 8 mm, khi chín nứt làm hai mảnh. Mùa quả: tháng 9-10. Các quả chín vẫn ở trên cây khá lâu vào mùa khô khi cây rụng hết lá.
Hạt núc nác hình bầu dục, rất mỏng, dẹt ba phía. Vỏ ngồi phát triển thành màng rất mỏng, màu trắng nâu nhạt với những đường gân tỏa ra từ hạt, trông như cánh bướm. Chiều dài cả hạt và cánh từ 4-7cm, rộng 2,5-4cm (nếu chỉ kể hạt khơng thì chỉ dài 1,5-2,5cm, rộng 1-2cm).
Hình 1.22: Quả và hạt cây núc nác
Vỏ núc nác không mùi, vị đắng, hơi hắc. Vỏ cuộn lại thành hình ống hay hình cung, dày 0,6 - 1,3 cm, dài ngắn khơng nhất định. Mặt ngồi màu vàng nâu
nhạt, nhăn nheo, có nhiều đường vân dọc, ngang. Mặt trong nhẵn, màu ngoài xám hay vàng lục. Mặt bẻ ngang có lớp bần mỏng, mơ mềm, vỏ lổn nhổn như có nhiều sạn, trong cùng có lớp sợi dễ tách theo chiều dọc.
3.3. Phân bố [1] [3] [6]
Núc nác có nguồn gốc từ tiểu lục địa Ấn Độ, ở dưới chân núi Hymalaya. Trên thế giới, núc nác phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới Châu Á, bao gồm Srilanka, Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc (Phúc Kiến, Quảng Tây, Vân Nam, Quý Châu, Tứ Xuyên, Hải Nam, Quảng Đông), Lào, Thái Lan, Campuchia, Philippin, đảo Selip và Timor của Indonesia.
Ở nước ta cây mọc hoang và được trồng khắp nơi, rải rác khắp các tỉnh miền núi và trung du như Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Yên Bái, Lai Châu, Điện Biên, Sơn La, Hịa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Bình, Quảng Trị, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Gia Lai, Kon Tum, Đắk Lắk, An Giang.
3.4. Dược tính [1] [3] [6]
Lá núc nác có tác dụng giảm đau, kháng khuẩn, kháng sinh, dùng để trị phù lá lách, đau bao tử…
Quả chát, ngọt có tác dụng làm dễ tiêu hóa, tăng cảm giác thèm ăn, trừ giun sán, bệnh tim, đau cổ họng, bệnh trĩ, viêm phế quản, bạch bì.
Hạt được sử dụng để điều trị trong những trường hợp ho hen không ngừng, đau dạ dày, đau bụng, nhiễm trùng họng, viêm khí quản, tăng huyết áp, mụn nhọt và vết thương.
Thân núc nác còn được dùng để trị dị ứng, rắn cắn, bọ cạp chích. Vỏ thân là thuốc lợi tiểu, trị bao tử, tiêu chảy và lỵ
Rễ dùng để trị bệnh tiêu chảy và lỵ, chống viêm, long đờm, chống giun, trị đau ngực và đầu. Vỏ rễ núc nác hăng, chát, cay, đắng, có tác dụng làm se ruột, làm
mát, hạ sốt, trị kiết, bạch bì, hen suyễn, tiêu chảy, thấp khớp, viêm phế quản, sưng tấy.
3.5. Thành phần hoá học
Bằng các phương pháp sắc ký, phổ nghiệm, các nhà khoa học đã cô lập, xác định cấu trúc và định danh được những hợp chất có trong từng bộ phận của cây núc nác. 3.5.1. Các hợp chất cô lập từ lá (Hình 1.23) R1 R2 H H Chrysin [38] OH H Baicalein [38] OH OH Scutellarein [32] HOOC HO O O HO OH R1 R2 O OH O R1 R2 H H Chrysin-7-O-glucuronid [38] OH H Baicalin [38] OH OH Scutellarin [32]
Hình 1.23: Các hợp chất cô lập từ lá cây núc nác
OH H O H HO H Acid ursolic [37] Hình 1.24: Các hợp chất cơ lập từ quả núc nác 3.5.3. Các hợp chất cô lập từ hạt (Hình 1.25) R1 R2 H OH Apigenin [35] OCH3 H Oroxylin A [9] OCH3 OH Hispidulin [35]
Hình 1.25: Các hợp chất cơ lập từ hạt cây núc nác 3.5.4. Các hợp chất cô lập từ vỏ thân (Hình 1.26) R1 R2 R3 OH H H Kaempferol [15] H OH OH 6-Hydroxyluteolin [12] R1 R2 R3 R4 OCH3 OH H H Oroxylin A [22] H OCH3 H H 7-O-Metylchrysin [13] OCH3 OH OH OH 6-Metoxyluteolin [12] 5-Hydroxy-7-metoxy-2-(2-metoxy-6(3,4,5-trihydroxy-6- (hydroxymetyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yoloxy)phenyl)-4H-chromen-4-on [13] Metyl-3,4,5-trihydroxy-6-(5-hydroxy-6-metoxy-4-oxo-2-phenylchroman-7- yloxy)-tetrahydro-2H-pyran-2-carboxylat [13]
Hình 1.26: Các hợp chất cơ lập từ vỏ thân cây núc nác
R =O 2-Acetyl-naphto[2,3-b]furan-4,9-dion [40] CH2OH 2-(1-Hydroxymetyletyl)-4H,9H-naphto[2,3-b]furan-4,9-dion [40] O O O
(2R)-Dihydro iso lapacon [40]
R
CH3 (3R,4R)-3,4-Dihydro-4-hydroxy-3-(3-metyl-2-butenyl)-1(2H)naphtalenon [40] CH2OH (3R,4R)-3,4-Dihydro-4-hydroxy-3-(3-metyl-2Z-butenyl)-1(2H)naphtalenon [40]
OH O OH (2R,3aR,5S,9bR)-2,3,3a,4,5,9b-Hexahydro-2-(1-hydroxy-1-metyletyl)-5-naphto[1,2-b]f uranol [40] Hình 1.27: Các hợp chất cơ lập từ vỏ rễ cây núc nác 3.6. Hoạt tính sinh học 3.6.1. Kháng khuẩn
Dịch chiết bằng CH2Cl2, hexan, CHCl3, CCl4 từ vỏ thân của cây núc nác có hoạt tính kháng lại một số vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis, Sarcina lutea và
Staphylococcus arureus), vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella boydii, Vibrio mimicus) cùng một vài loại nấm (Candida albicans, Aspergillus niger). [15]
3.6.2. Chống lại tác nhân gây đột biến
Ames cùng các cộng sự đã xác định khả năng chống lại tác nhân gây biến Trp-P-1 (3-amino-1,4-dimetyl-5H-pyrido[4,3-b]indol) trong thức ăn của dịch trích MeOH từ quả núc nác. Tác nhân ức chế chính được xác định là baicalein với giá trị IC50 là 2,78 ± 0,15 μM. [28]
3.6.3. Chống ung thư
Nghiên cứu 11 cây thuốc được dùng trị bệnh trong dân gian ở Bangladesh, kết quả cho thấy dịch núc nác cho hoạt tính độc tế bào mạnh nhất với tất cả tế bào khối u. Giá trị IC50 là 19,6 mg mL-1 với CEM, 14,2 mg mL-1 với HL-60, 17,2 mg mL-1 với B-16 và với HCT-8 là 32,5 mg mL-1. [21]
3.6.4. Ức chế tăng sinh tế bào
Dịch EtOH của vỏ thân núc nác cho hoạt tính ức chế tăng sinh với một số tế bào như erythleukemic K 562 (IC50 = 30,77 ± 0,32 mg mL-1), lympho B Raji (IC50 = 23,20 ± 9,6 mg mL-1), lympho T Jurkat (IC50 = 4,11 ± 0,10 mg mL-1). [18]
Như chúng ta đã biết, bệnh đái tháo đường là một căn bệnh mãn tính nguy hiểm và đang tăng dần trên tồn thế giới. Trong đó, số người bị đái tháo đường loại 2 chiếm đến 90% các trường hợp mắc bệnh. Một phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường loại 2 được quan tâm hiện nay là làm giảm sự tạo thành glucose thông qua việc ức chế enzym -glucosidase. Mặc dù hiện nay trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại thuốc trị đái tháo đường loại 2 theo hướng này nhưng chúng vẫn còn nhiều tác dụng phụ. Do đó, việc tìm kiếm hợp chất mới có khả năng ức chế enzym
-glucosidase từ thiên nhiên luôn được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế
giới.
Theo tham khảo tài liệu, có nhiều loại hợp chất có hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase, điều này cho thấy tiềm năng to lớn trong việc cô lập các hoạt chất này từ tự nhiên. Trong phạm vi đề tài, chúng tôi tập trung nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của một số cây thuốc ở vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang là nơi có nhiều cây thuốc quý vẫn chưa được nghiên cứu. Từ kết quả sàng lọc các mẫu cây thuốc ban đầu, chúng tơi sẽ chọn ra cây thuốc có hoạt tính mạnh để tiến hành cơ lập, xác định cấu trúc và nghiên cứu hoạt tính các hợp chất.
THỰC NGHIỆM
1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 1.1. Hóa chất
Acetonitril (SCharlau)
Cloroform (cơng nghiệp, Chemsol 99%) Dimethyl sulfoxid (DMSO) (Trung Quốc 98%) Etyl acetat (công nghiệp, Chemsol 99,5%) Hexan (Chemsol)
Metanol (công nghiệp, Chemsol 99,7 )
α-Glucosidase from Saccharomyces cerevisae (Sigma G 0660-750UN) p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranodase (pNPG) (Sigma N1377-1G)
Acid tannic (Merck)
NaH2PO4.2H2O (Trung Quốc 99%) Na2HPO4.12H2O (Trung Quốc 99%) Na2CO3 (Trung Quốc 99,8%)
Sắc ký cột: silica gel pha thường (HIMEDIA 230-400 mesh), pha đảo (Merck).
Sắc ký bản mỏng: pha thường (Kielselgel 60 F245), pha đảo (60 RP-18 F254S).
1.2. Thiết bị
Bồn điều nhiệt. Cân kỹ thuật. Cân phân tích.
Đèn UV-VIS (Spectroline MODEL ENF-240C/FE, USA). Hệ thống đông cô chân không.
Hệ thống cô quay chân không.
Máy quang phổ (SHIMADZU UV-1800).
Máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker Ultrashield 500 Plus).
1.3. Dụng cụ
Becher 1000 mL, 500 mL, 100 mL, 50 mL. Bình cầu 2000 mL, 1000 mL, 500 mL.
Bình quả lê 1000 mL, 500 mL, 250 mL, 100 mL. Erlen 1000 mL, 500 mL, 250 mL, 100 mL. Fiol 1000 mL, 100 mL, 25mL, 20 mL, 5 mL. Phễu chiết 2000 mL, 1000 mL. Ống COD. Pipet 10 mL; 2mL; 0,1 mL. Micropipet. Vial nhựa 1,5 mL; 2 mL. Cuvet thủy tinh.
Cột sắc ký điều chế.
Và các dụng cụ thông thường khác như đũa thủy tinh, giấy lọc, …
2. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE2.1. Điều chế cao thơ 2.1. Điều chế cao thơ
2.1.1. Ngun liệu
Với mục đích sàng lọc, tìm ra những cây thuốc có hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase từ nguồn cây thuốc dồi dào của Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thu thập ngẫu nhiên mẫu cây thuốc từ các vùng miền trong cả nước và khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của chúng. Trong phạm vi đề tài, chúng tôi tập
trung nghiên cứu 40 cây thuốc ở vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang (Bảng 2.1). Các cây được lựa chọn trong đề tài theo tiêu chí là các cây có cơng dụng trị bệnh đái tháo đường, ung thư, kháng viêm trong dân gian, theo tài liệu tham khảo hoặc lựa chọn ngẫu nhiên.
Những cây thuốc này được thu hái vào tháng 8 năm 2009 và được định danh bởi Thạc sĩ Hoàng Việt, khoa Sinh Học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên.
Bảng 2.1: Danh mục các cây thuốc nghiên cứu trong đề tài [3] [4]