- ðể ñ ánh giá tính kháng virus PVY của các con lai soma và các dòng ”b ố mẹ” chúng tôi sử dụng hai cặp mồi ñặc hiệ u theo Czech J Gennet (2007).
N ội dung 3: ghiên cứu ñ ánh giá sự sinh trưởng, phát triển, năng suất và ph ẩm chất củ của các con lai soma khoai tây và cây ”bố mẹ” (trồng trong
2.3.1. Các phương pháp nghiên cứu trong phòng
2.3.1.1. Phương pháp nuôi cấy mô hiện hành:
Các con lai soma khoai tây và “bố mẹ” của chúng ñược nuôi cấy in vitro trong môi trường MS. Cây in vitro ñược ñặt trong phòng nuôi theo chế ñộ nhiệt ñộ là 210C, cường ñộ chiếu sáng 3000 – 4000 lux, quang chu kỳ 16h chiếu sáng/ngàỵ
2.3.1.2.Phương pháp chiết tách DNA
Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA tổng số của GS. Hans – Joerg Jacobsen trường ðại học Hannover (Phụ lục 3), tiến hành kiểm tra ñộ
nguyên vẹn của DNA tổng số bằng ñiện di trên gel agarose 1%. Nếu ñạt yêu cầu thì thực hiện thí nghiệm chạy phản ứng PCR với cặp mồi ñặc hiệụ
2.3.1.3. Phương pháp ñánh giá khả năng kháng virus bằng phương pháp DAS – ELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme – linked imunosorbent assaỵ Bước 1: Cốñịnh kháng thể IgG ñặc hiệu của virus vào bản ELISA
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 26
bản ELISA trong hộp ẩm có nắp ñậy, ñể vào tủ ấm ở nhiệt ñộ 370C trong 2 giờ. Sau khi ủ, các giếng ñược rửa bằng dung dịch ñệm rửa (PBS-T) 4 lần.
Bước 2: Cốñịnh dịch cây vào bản ELISA
Nghiền mỗi mẫu 1g trong ñệm chiết với ñộ pha loãng 1/10. Dịch cây
ñược nhỏ vào bản ELISA với lượng 200µl/1giếng. ðồng thời cho 200µl dung dịch ñối chứng âm và 200µl dung dịch ñối chứng dương vào các giếng ñánh dấu riêng. Ủ bản Elisa ở 370C trong 2 giờ. Sau khi ủ các giếng ñược rửa bằng dung dịch ñệm rửa (PBS-T) 4 lần, mỗi lần trong 5 phút.
Bước 3: Cốñịnh IgG liên kết Enzyme
Hòa IgG liên kết enzyme (IgG – E) trong dung dịch ñệm liên kết. Cho vào mỗi giếng 200µl. Bản ELISA ñược ủ trong 2 giờ và rửa như bước 2.
Bước 4: Cốñịnh chất nền vào bản ELISA
Hòa chất nền NPP (nitrophenol phosphate) vào dung dịch ñệm subtra theo tỷ lệ ñã chọ Sau ñó nhỏ vào mỗi giếng 200µl. Bản ELISA ñể trong hộp
ẩm ñược ñặt ở nhiệt ñộ phòng. Quan sát sự phản ứng màu ở các giếng. Sau 1 giờ các giếng có màu vàng là các giếng có phản ứng dương tính, giếng không có màu là không có phản ứng. Kết quảñược ñọc chính xác hơn trên máy ñọc ELISA ở bước sóng 405nm.
2.3.1.4. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu chất lượng. * ðịnh lượng ñường khử (phương pháp iod-Ixekutz)
Nguyên liệu: Dịch chiết ñược chuẩn bị theo phương pháp Bertrand (phụ lục 6).
Tiến hành: lấy 2 bình tam giác: Bình 1 (ñối chứng), bình 2 (thí nghiệm).
Cho vào bình 1: 5ml nước cất, bình 2: từ 2 – 5ml dịch chiết ñường, cho vào mỗi bình 10ml K3Fe(CN)6 0.05N. ðun sôi 1 phút trên bếp ñiện, ñể nguộị Cho vào mỗi bình 10ml hỗn hợp (ZnSO4 + KI), 10ml CH3COOH 10%.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 27
tinh bột (dung dịch chuyển màu xanh), chuẩn ñộ tiếp cho tới khi có màu trắng sữa hoàn toàn.
* ðịnh lượng tinh bột (phương pháp thủy phân bằng axit)
Nguyên tắc: Dưới tác dụng của axit tinh bột ñược thủy phân hoàn toàn thành ñường glucosẹ ðịnh lượng ñường khử, suy ra hàm lượng tinh bột.
Nguyên liệu: 2g củ khoai tây
Tiến hành: Nghiền 2g nguyên liệu, nghiền nhỏ, trộn ñều chuyển sang cốc. Cho vào cốc 100ml nước cất, khuấy ñều từ 45-60 phút. Sau ñó lọc bằng phễu có giấy lọc. Tráng cốc và rửa tinh bột nhiều lần bằng nước cất ñể loại toàn bộñường khử khỏi tinh bột.
Chuyển phễu lọc chứa tinh bột sang bình 250ml, dùng ñũa thủy tinh nhỏ chọc thủng giấy lọc, chuyển tinh bột xuống bình cầu bằng nước cất (80- 100ml). Sau ñó cho 125ml HCl 25% vào bình. ðặt bình vào nồi cách thủy sôi,
ñun nóng từ 3-4h, thỉnh thoảng lắc ñềụ Sau khi kết thúc thủy phân tinh bột, làm nguội bình, trung hòa dịch thủy phân bằng NaOH 10%, dùng giấy quỳ
thử sao cho dung dịch thủy phân không thừa kiềm. Sau ñó thêm 1-2 giọt HCl 25% ñể dung dịch thủy phân ñã ñược trung hòa có ñộ axit yếụ Chuyển toàn bộ dung dịch sang bình ñịnh mức 100ml, dùng nước cất ñịnh mức tới mức của bình. Khuấy ñều, lọc dung dịch, dung dịch lọc trong suốt, ñể ñịnh lượng
ñường khử.