32 Hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO)

2 3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

22 32 Hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO)

Hoạt tính ức chế sản sinh NO của các dịch chiết và các chất sạch được thưc hiện theo phương pháp của Griess trên đại thưc bào của chuột (RAW264 7 đối với các chất từ cây Na rừng (thưc hiện tại khoa Dược - Đại học Tôn Đức Thắng - Thành phố Hồ Chí Minh và BV-2 với các chất từ cây Thông đất, thưc hiện tại Đại học Dược Wonkwang, Hàn Q́c) kích thích bởi LPS [57]

a Ngun lý chung:

Gớc tư do nitric oxide (·NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau Khi xuất hiện các đáp ứng viêm, dạng ·NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thưc bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thường được sản sinh với lượng lớn

*Phương pháp gián tiếp để xác định ·NO là xác định màu sắc của sản phẩm của nó (nitrate và nitrite) Trong phản ứng này, nitrate (NO3-) chuyển thành nitrite (NO2-), do tác động của nitrate reductase

Khi xử lý với thuốc thử Griess, nitrite chuyển thành màu hồng theo phản ứng sau:

*Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả năng

sớng sót của tế bào Ở các tế bào sống, hệ enzym oxidoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan khơng hoà tan, màu tím đậm theo phương trình phản ứng sau:

Do vậy, tỉ lệ tế bào sớng sót được suy ra từ lượng formazan tạo thành từ MTT Lượng formazan tạo thành được hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo đợ hấp thụ ở bước sóng 570 mm Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm được suy ra từ việc đánh giá khả năng sớng sót của tế bào [61]

b Phương pháp thực hiện

Tế bào (RAW264 7 hoặc BV-2) được nuôi cấy với nồng độ 5 x 105 tế bào/mL trong môi trường DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin G (100 U/mL), streptomycin (100 mg/L) và L-glutamine (2 mM) Sau đó, mơi trường được thay thế bằng mơi trường mới chứa 100 g/mL LPS và các hợp chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau, giữ ổn định trong 24 h Sư sản sinh NO được đánh giá dưa vào sư tích tụ nitrite trong dịch nổi của tế bào sử dụng thuốc thử Griess Dung dịch DMSO 1% được sử dụng làm mẫu trắng, butein, dexamethasone, sulfuretin được sử dụng làm mẫu đối chứng [57]

NaNO2 ở các nồng độ khác nhau được sử dụng để xây dưng đường chuẩn Độ hấp thụ được đo ở 570 nm

Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính in vitro được bổ sung dung dịch MTT (0,5 mg/mL pha trong PBS), ủ 4 h ở 37oC và 5% CO2 Sau đó hút bỏ hết mơi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol Độ hấp thụ được đo ở 570 nm

c Tính tốn - % ức chế NO % ức chế = x 100 Trong đó: A-C: nồng đợ NO2- (µM) A: LPS (+) mẫu (-) B: LPS (+) mẫu (+) C: LPS (-) mẫu (-)

Khả năng ức chế nitrite cho nồng độ ức chế trung bình IC50 – giá trị được tính toán bằng chương trình GraphPad Prism, version 8 4 0 (GraphPad Software Inc , USA)

- Tính giá trị CS % (% Cell Survival)

Giá trị CS: là khả năng sớng sót của tế bào ở nồng đợ ban đầu của mẫu thử, Giá trị CS (%) được tính theo cơng thức:

CS% = ±

OD: mật độ quang

σ: độ lệch tiêu chuẩn được tính theo cơng thức:

Trong đó: xi: giá trị OD tại giếng i, : giá trị OD trung bình n: sớ giếng thử lặp lại

- Tính giá trị IC50

Nồng đợ ức chế 50%, IC50 được xây dưng trên 5 nồng độ thử nghiệm Giá trị IC50

được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 8 4 0

% ức chế tế bào = x 100

Trong đó:

HighConc/LowConc: chất thử ở nồng đợ cao/chất thử ở nồng độ thấp HighInh%/LowInh%: % ức chế ở nồng độ cao/% ức chế ở nồng độ thấp