Toàn cây Thông đất sau khi thu hái về được rửa sạch, phơi khô và nghiền nhỏ thu được 5,2 kg bột dược liệu khô Lượng bột này được ngâm chiết với methanol ở nhiệt đợ phịng (3 lần x 10 L) trong 24 h Dịch chiết methanol được đem đi cô quay thu được cặn chiết tổng (360 g) Cặn chiết này đem hòa vào 2 L nước và chiết phân bố lần lượt với n-hexane, ethyl acetate và cô quay dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết n-hexane (H), cặn chiết ethyl acetate (E) và dịch chiết nước (W) Sơ đồ ngâm chiết được thể hiện trên hình 3 1
Hình 3 1 Sơ đồ ngâm chiết thân cây Thông đất
Dịch nước được phân tách trên cột Diaion HP-20 và rửa giải với hệ dung môi
MeOH/nước với tỷ lệ lần lượt là 100/1; 50/50 và 100/0) thu được 3 phân đoạn W1- 3
Phân đoạn W2 (3,2 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP18 sử dụng hệ dung môi rửa giải là MeOH/nước (1/2 đến 2/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ (W2A-W2D)
Hợp chất LC1 (1,0 mg) thu được từ phân đoạn W2A tinh chế trên cột pha đảo RP18 hệ MeOH/acetone/H2O (8/1/1) và chạy qua cột Sephadex™ LH-20
Phân đoạn W2C được chạy sắc ký cột pha thường với hệ dung môi
CH2Cl2/MeOH/acetone/H2O (6/5/0,04/0,1) thu được 3 phân đoạn nhỏ W2C1- W2C3
Hợp chất LC18 (3,0 mg) thu được bằng cách tinh chế phân đoạn W2C1 trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là EtOAc/MeOH/H2O (7/1/0,1) và qua cột SephadexTM LH-20 sử dụng hệ dung môi MeOH/H2O (1/1)
Tinh chế phân đoạn W2C3 (150 mg) trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi EtOAc/MeOH/H2O (7/1/0,1) và sắc ký cột pha đảo RP18 hệ dung môi MeOH/H2O (1/3 và 1/2) thu được hợp chất LC19 (4,0 mg) và LC20 (13,0 mg) và LC2 (4,0 mg)
Phân đoạn W2D (640,0 mg) được tiến hành sắc ký cột pha thường hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/acetone/H2O (6,5/1/0,04/0,1) và cột Sephadex™ LH-20 rửa giải bằng hệ dung môi MeOH/acetone/H2O (8/1/1) thu được hợp chất LC3 (3,0 mg) và
LC4 (24,0 mg)
Hình 3 2 Sơ đồ phân lập dịch nước của cây Thông đất
Cặn chiết Ethyl acetate (60 g) được tách thành 4 phân đoạn nhỏ E1-E4 bằng
cách sắc ký cột pha thường sử dụng hệ dung môi n-hexane/EtOAc (10/1 đến 0/1) Phân đoạn E3 (30 g) được tiến hành sắc ký cột pha thường hệ dung môi n- hexane/EtOAc (20/1 đến 1/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ E3A-E3D
Tinh chế phân đoạn E3B (7,0 g) trên cột sắc ký pha đảo RP18 hệ dung môi acetone/H2O (4/3) thu được hợp chất LC6 (2,5 mg) và LC12 (9,0 mg)
Phân đoạn E3C (14,0 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo hệ dung môi MeOH/H2O (1/1) và tinh chế thêm trên cột sắc ký pha thường hệ dung môi CH2Cl2/acetone (6/1) thu được các hợp chất LC5 (10,0 mg); LC7 (2,0 mg); LC8 (4,0 mg) và LC9 (5,0 mg);
Tinh chế phân đoạn E3D (2,8 g) trên cột sắc ký pha đảo RP18 hệ dung môi acetone/H2O (1/3) và tinh chế thêm trên cột silica gel pha thường hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (20/1) thu được hợp chất LC16 (10,0 mg) và LC17 (5,0 mg)
Tiến hành sắc ký cột pha thường phân đoạn E4 (15g) hệ dung môi n- hexane/EtOAc (6/1 đến 1/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ E4A-E4D
Tinh chế phân đoạn E4A (1,4 g) trên sắc ký cột pha đảo RP18 hệ dung môi MeOH/H2O (8/1) và cột Sephadex™ LH-20 sử dụng hệ MeOH/H2O (1/1) thu được hợp chất LC10 (10,0 mg); LC11 (50,0 mg); LC13 (15,5 mg) và LC14 (5,0 mg)
Phân đoạn E4D (1,0 g) được tinh chế trên sắc ký cột pha đảo RP18 với hệ dung môi acetone/H2O và tiếp tục sắc ký cột pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (15/1) thu được hợp chất LC15 (6,0 mg)
Hình 3 3 Sơ đồ phân lập cặn EtOAc của cây Thông đất
3 1 2 Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ lồi Thơng đất
3 1 2 1 Hợp chất LC1: Lycocernuaside E (hợp chất mới)
Chất bợt màu trắng
HR-ESI-MS: m/z 559,1587 [M+Cl]−
KLPT chính xác (tính toán) [C25H32O12Cl]-: 559,1588 Công thức phân tử: C25H32O12, Mw = 524 g/mol
1 3 1 2 2 Hợp chất LC2: Lycocernuaside A Chất bột màu trắng 1 3 1 2 3 Hợp chất LC3: Bombasin 4-O-β-D-glucopyranoside Chất bột màu trắng
H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4 1 3
3 1 2 4 Hợp chất LC4: Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside glucopyranoside Chất bột màu trắng 1 3 1 2 5 Hợp chất LC5: Cedrusin Chất rắn không màu 1
H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4 1 1
H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4 1 2
H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4 1 4
3 1 2 6 Hợp chất LC6: Lycernuic B (hợp chất mới)
Chất bợt màu trắng
Góc quay cưc riêng: − 54 3 (c 0,04, MeOH) HR-ESI-MS: m/z 595,4002 [M-H]-
KLPT chính xác (tính toán) [C37H55O6]-: 595,4004 CTPT: C37H56O6 Mw = 596 g/mol
1
3 1 2 7 Hợp chất LC7: Lycocernuic ketone F (hợp chất mới)
Chất bợt màu trắng
Góc quay cưc riêng: − 31,6 (c 0,1; MeOH) HR-ESI-MS: m/z 473,3628 [M+H]+
KLPT chính xác (tính toán) [C30H49O4]+: 473,3625 CTPT: C30H48O4 Mw = 472 g/mol 1 3 1 2 8 Hợp chất LC8: Lycernuic ketone C Chất rắn không màu 1 4 1 8 3 1 2 9 Hợp chất LC9: Lycernuic ketone B
Dạng dầu không màu
1 3 1 2 10 Hợp chất LC10: Lycoclavanol Chất bột màu trắng 1 4 1 10 3 1 2 11 Hợp chất LC11: 3-epi-lycoclavanol Chất bột màu trắng 1 4 1 11 3 1 2 12 Hợp chất LC12: Methyl lycernuate B Chất rắn không màu 1 4 1 12 3 1 2 13 Hợp chất LC13: Lycernuic acid B Chất rắn không màu 1 4 1 13 3 1 2 14 Hợp chất LC14: 3β,21β,24-trihydroxyserrat-14-en-16-one Chất bột màu trắng 1 4 1 14 3 1 2 15 Hợp chất LC15: Apigenin-4′-O-(2′′-O-p-coumaroyl)-β-D-
H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng
H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4 1 9 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng
H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4 1 7 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4 1 6
glucopyranoside
Chất bột màu vàng
1
3 1 2 16 Hợp chất LC16: Apigenin-4′-O-(6′′-O-p-coumaroyl)-β-D- glucopyranoside
Chất bột màu vàng
1
4 1 16
3 1 2 17 Hợp chất LC17: Apigenin-4′-O-(2′′,6′′-di-O-trans-p-coumaroyl)-β-D- glucopyranoside
Chất bột màu vàng nhạt
1 4 1 17 3 1 2 18 Hợp chất LC18: Cernuine Chất bột màu trắng 1 3 1 2 19 Hợp chất LC19: Lycocernuine Chất bột màu trắng 1 3 1 2 20 Hợp chất LC11: Cermizine C N-Oxide Chất bột màu trắng 1
3 2 Phân lập các chất từ loài Na rừng (Kadsura coccinea (Lem ) A C Sm )