Hình 15: Khuẩn lạc dịng L10 4.1.3 Kết quả quan sát hiển vi
Sau khi nấm xuất hiện bào tử, làm mẫu và quan sát đặc điểm vi thể của các dịng nấm dưới kính hiển vi được ghi nhận trong bảng 6.
Bảng 6: Đặc điểm hiển vi của các dòng nấm phân lập đƣợc Dòng nấm Cọng bảo tử Hình dạng bào tử Khuẩn ty
GL1
Chuỗi Hình trứng Có vách, khơng phân nhánh, màu sậm GL2 Chùy Trịn Có vách GL3 Chùy Trịn Có vách GL4 Chùy Trịn Có vách GL5 Chùy Trịn Có vách GL6 Chuỗi Hình trứng Có vách L1 Chùy Trịn Có vách L2 Chùy Trịn Có vách L3 Chùy Trịn Có vách L4 Chùy Trịn Có vách L5
Chuỗi Trịn Có vách, khơng phân
nhánh, màu sậm L7 Túi Trịn Có vách L8 Túi Trịn Khơng có vách L10 Chùy Trịn Có vách YL1 Chùy Trịn Có vách YL2 Chùy Trịn Có vách YL3 Cọ vẽ Trịn Có vách YL4 Chùy Trịn Có vách YL5 Chùy Trịn Có vách YL6 Chuỗi Trịn Có vách LD1 Chùy Oval Có vách YD1 Chùy Trịn Có vách YD2 Túi Trịn Có vách
YD3 Cọ vẽ Trịn Khơng có vách GV1 Túi Trịn Có vách LV1 Túi Oval Có vách LV2 Túi Trịn Có vách LV3 Chùy Trịn Có vách YV1 Cọ vẽ Oval Có vách LN1 Chùy Trịn Có vách
Hình 16: Khuẩn ty và bào tử của dòng GL6
4.2 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn
4.2.1 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn
Các dòng nấm phân lập được thử nghiệm với 7 loại vi khuẩn kiểm định trong đó có Escherichia coli chủng 1, Escherichia coli chủng 2, Salmonella enterica, Bacillus cereus, Edwarsiella ictaluri chủng 1, Edwarsiella ictaluri chủng 2, Candida albicans.
Các dòng nấm phân lập được cấy trực tiếp lên môi trường đã trãi đều vi khuẩn kiểm định, sau đó đem ủ 48 giờ, quan sát và đo đường kính vịng vơ khuẩn.
Hình 18: Khuẩn ty và túi bào tử của dịng YD2
Hình 20: Vịng vơ khuẩn do dịng GL6 tạo ra trên vi khuẩn E.coli chủng 2
Hình 21: Vịng vơ khuẩn do dịng nấm L5 (phía dƣới bên trái) và dịng L10 (phía trên bên phải) tạo ra trên vi khuẩn Edwarsiella ictaluri chủng 2
Kết quả theo dõi đo đạt kích thước halo và khuẩn lạc thu được ghi nhận kết quả trong Bảng 7.
Bảng 7: Kết quả thí nghiệm theo dõi khả năng đối kháng vi sinh vật kiểm định trên mơi trƣờng LB Dịng nấm Đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm) A E1 E2 B Ec1 Ec2 S GL2 19 18 20 9 9 - 24 GL3 20 14 18 8 7 9 20
GL4 - 10 - 8 - - 14 GL5 21 19 19 9 9 12 23 GL6 - 7 - - - - - L1 19 20 15 10 7 10 18 L2 14 10 8 - 7 7 16 L3 9 9 10 - 4 - 17 L4 17 13 15 6 10 10 18 L5 18 14 12 - 8 6 18 L6 7 5 9 - - - 6 L9 6 4 3 - - - 8 L10 19 18 15 - 7 8 20 YL1 19 15 12 12 6 7 20 YL2 7 6 14 - 6 - 8 YL3 12 12 14 - 6 6 14 YL4 17 14 11 12 - 8 20 YL5 15 12 11 10 - 9 18 YL6 15 15 - - - 9 15 LD1 20 16 15 - 10 8 25 YD1 15 13 11 7 5 8 15 YD2 16 14 12 12 7 8 18 YD3 10 7 - - - - 10 GV1 15 13 9 6 6 - 18 LV1 14 9 10 6 5 5 16 LV3 - 20 18 - 7 8 18 YV1 15 15 13 6 15 13 17 LN1 16 14 11 8 6 - 18
28 dòng 25 28 24 15 20 18 27
Chú thích:
A: Candida albicans.
E1: Edwarsiella ictaluri chủng 1. E2: Edwarsiella ictaluri chủng 2. B: Bacillus cereus.
Ec1: Escherichia coli chủng 1. Ec2: Escherichia coli chủng 2. S: Salmonella enterica.
Kết quả cho thấy các dịng nấm có khả năng tạo vịng vơ khuẩn là các dịng nấm có khả năng sản sinh các chất có khả năng kháng khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Dựa vào đường kính vịng vơ khuẩn có thể chọn ra các dòng nấm có hoạt tính kháng khuẩn mạnh.
4.2.2 Tuyển chọn các dịng nấm có khả năng tạo hoạt tính kháng khuẩn cao
Từ kết quả trong bảng 7 cho thấy, hoạt tính kháng khuẩn thu được của 28 dòng nấm mốc thơng qua đường kính vịng vơ khuẩn chọn ra 18 dịng nấm có khả năng tạo hoạt chất kháng kháng khuẩn cao được tổng hợp trong bảng 8:
Bảng 8: Các dòng nấm mốc và đƣờng kính vịng vơ khuẩn trên mơi trƣờng LB Dịng nấm Đƣờng kính (mm) Dịng nấm Đƣờng kính (mm) GL2 25 YL1 20 GL3 20 YL3 14 GL5 23 YL4 20 L1 20 LD1 24 L2 16 YD1 15 L3 17 YD2 18 L4 18 GV1 18 L5 18 LV1 16 L10 20 LV3 20
Trong đó dịng nấm mốc GL2 có đường kính vịng vơ khuẩn là 25 mm, LD1 (24 mm), GL5 (23 mm) và các dòng GL3, L1, L10, YL1, YL4, LV3 (20 mm) các dòng nấm mốc trên có đường kính lớn hơn 20 mm, rõ ràng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Các dòng nấm cịn lại có đường kính halo dao động từ 14 – 18 mm có hoạt tính trung bình.
Hình 22: Các dịng nấm mốc 1 – YL3; 2 – YL6; 3 – YD1; 4 – YV1 tạo vịng vơ khuẩn ở vi khuẩn Edwarsiella ictaluri chủng 1.
Hình 23: Các dòng nấm mốc 1 – L1; 2 – LD1; 3 – LV3; 4 – L1 tạo vịng vơ khuẩn ở nấm men Candida albicans
CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 5.1 Kết luận
Kết quả đề tài đã phân lập được 33 dòng nấm mốc từ 23 mẫu Hải miên vùng biển Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang. Mô tả sơ bộ đặc điểm đại thể và đặc điểm vi thể của các dòng nấm trên môi trường Glucose Peptone Yeast Extract Agar (GPY), Gause 1, Luria Bertani Agar (LB) về kích thước, cấu trúc, màu sắc khuẩn lạc và đặc điểm của bào tử...
Bằng phương pháp khối thạch, dựa vào đường kính vịng vơ khuẩn đã thu được 9/33 dịng nấm mốc có khả năng kháng khuẩn cao, dựa trên đường kính vịng vơ khuẩn > 20 mm, bao gồm 7 dòng từ hải miên có nguồn gốc ở Hòn Rễ Lớn, ký hiệu là GL2 (25 mm), GL5 (23 mm), GL3 (20 mm), L1 (20 mm), L10 (20 mm), YL1 (20 mm) và YL4 (20 mm); 1 dòng từ Hòn Núi Đèn, ký hiệu là LD1 (24 mm); 1 dòng từ Hòn Kiến Vàng, ký hiệu là LV3 (20 mm).
Nhìn chung các dịng nấm có hoạt tính kháng khuẩn cao có khuẩn lạc hình trịn hay gần trịn, mép hình tia, bào tử có màu đen, nâu đen, nâu vàng, có dạng mặt nhung mịn, hạt đen mỏng hay dày, kích thước khuẩn lạc trung bình 50 ÷ 60 mm, bề mặt khuẩn lạc hơi mô. Tất cả 7 dòng nấm khuẩn ty đều có vách, phân nhánh, không màu hay màu nhạt, sinh sản bằng bào tử đính, bào tử có hình trịn, gần tròn hay oval, thể bình lớn. Nhận xét các đặc điểm đại thể và vi thể định danh sơ bộ ban đầu các dòng nấm có hoạt tính kháng khuẩn cao thuộc Chi nấm Aspergillus.
5.2 Kiến nghị
Tiếp tục thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn các dòng nấm phân lập được trên các dòng vi sinh vật kiểm định khác.
Nghiên cứu phương pháp tinh sạch làm tăng hoạt tính kháng khuẩn và các ứng dụng từ các dòng nấm mốc trên.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Bùi Xuân Đồng (2004). Nguyên lý phòng chống nấm mốc & mycotoxin. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành (2010). Giáo trình Nấm học.
Đặng Vũ Hồng Miên (1999). Bảng phân loại các loài nấm mốc thường gặp. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Lê Xuân Phương (2001). Vi sinh vật công nghiệp. NXB Xây dựng ĐH Đà Nẵng. Lương Đức Phẩm (2007). Công nghệ vi sinh vật. NXB Nông Nghiệp.
Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1978). Vi sinh tổng hợp. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội
Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn (2001). Thực tập vi sinh vật học. Trường Đại học Kỹ Thuật Thành phố Hồ Chí Minh.
Nguyễn Lân Dũng (1983). Một số sản phẩm của vi nấm. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998). Vi sinh vật học. NXB Giáo Dục.
Nguyễn Lân Dũng. Vi sinh vật tổng hợp. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Nguyễn Thành Đạt (2005). Cơ sở sinh học vi sinh vật. Tập 1,2. NXB Y học, Hà Nội. Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Như Thành, Dương Đức Tiến (2004). Vi sinh vật nông
nghiệp. NXB Đại học Sư Phạm.
Trần Thị Thanh (2007). Công nghệ vi sinh. NXB Giáo Dục.
Tiếng anh
Bo Ding, Ying Yin, Fengli Zhang, Zhiyong Li. 2009. Recovery and Phylogenetic Diversity of Culturable Fungi Associated with Marine Sponge Clathrina luteoculcitella and Holoxea sp. in the South China Sea. Mar Biotechnol 13: 713 – 721.
Bhat KM, Hay AJ, Claeyssens M, Wood TM. 1990. Study of the mode of action and site-specificity of the endo-(1-4)-beta-D-glucanases of the fungus Penicillium
pinophilum with normal, 1-3H-labelled, reduced and chromogenic cello oligosaccharides. Biochem J 266: 371-378.
Blehert DS, Hicks AC, Behr M, Meteyer CU, Berlowski-Zier BM, Buckles EL, Coloman JT, Darling SR, Gargas A, Niver R, Okoniewski JC, Rudd RJ, Stone WB. 2009. Science 227 – 323.
Blunt JW, Copp BR, Hu WP, Munro MH, Northcote PT, Prinsep MR. 2007. Marine natural products. Nat Prod Rep 24: 31 – 86.
Bridge PD, Newsham KK. 2009. Soil fungal community composition at Mars Oasis, a southern maritime Antarctic site, assessed by PCR amplification and cloning. Fungal Ecol 2: 66 – 74.
Bugni PS, Ireland CM. 2004. Marine-derived fungi: a chemically and biologically diverse group of microorganisms. Nat Prod Rep 21: 143 – 163.
Chen BE, Zhang SL. 2006. Antimicrobial characteristics of marine fungi Aspergillus sp. MF 134. J. Huaqiao Univ 27: 307 – 309.
Coker PS, Radecke J, Guy C, Camper ND. 2003. Potato disc tumor induction assay: a multiple mode of drug action assay. Phytomed 10: 133 – 138.
Coral G, Burhan A, Unaldi M, Guvenmez H. 2002. Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type strain. Turk J Biol 26: 209-213.
Dahot M, Noomrio M. 1996. Microbial production of cellulase by Aspergillus fumigatus using wheat straw as a carbon sourc., J Islamic Acad Sci 9: 119 -124. Frisvad JC, Samson RA. 2004. Polyphasic taxonomy of Penicillium subgenus
Penicillium: A guide to identification of food and air-borne terverticillate Penicillia ans their mycotoxins. Stud Mycol 49: 1 – 174.
Gao Q, Yang ZL. 2010. Ectomycorrhizal fungi associated with two species of Kobresia in an alpine meadow in the eastern Himalaya. Mycorrhiza 20: 281 – 287.
Gao Z, Li B, Zheng C, Wang G. 2008. Molecular detection of fungal commu in the Hawaiian marine sponges Suberites zeteki and Mycale armata. Appl Environ Microbiol 74: 6091 – 6101.
Grasso S, Bruni V, Maio G. 1997. Marine fungi in Terra Nova Bay. New Microbiol 20: 371 – 376.
Han XX, Xu XY, Cui CB, Gu QQ. 2007. Diketopiperazines produced by marine- derived Aspergillus fumigatus H1-04 anf their antiumor activities. Chin. I. Med. Chem. 17: 155 – 159.
Jan Vicente, Allison Stewart, Bongkeun Song, Russell T. Hill, Jeffrey L. Wright. 2012. Biodiversity of Actinomycetes Associated with Caribbean Sponges and Their Potential for Natural Product Discovery. Mar Biotechnol 15: 413 – 424. Jutta Wiese. 2011. Phylogenetic Identification of Fungi Isolated from the Marine
Sponge Tethya aurantium and Identification of Their Secondary Metabolites. Mar. Durgus 9: 561 – 585.
Li CS, Li XM, Gao SS, Lu YH, Wang BG. 2013. Cytotoxic anthranilic acid derivatives from deep sea sedimet-derived fungus Penicillium paneum SD-44. Mar. Drugs 11: 3068 – 3076.
Li Q, Wang G. 2009. Diversity of fungal isolates from three Hawaiin marine sponges. Microbiol Res 164: 231 – 235.
Liu WC, Li CQ, Zhu P, Yang JL, heng KD. 2010. Phylogenetic diversity of culturable fungi associated with two marine sponges: Haliclona simulans and Gelliodes carnosa, collected from the Hainan Island coastal waters of the South China Sea. Fungal Div 42: 1 – 15.
Marlene Heríquez, Karen Vgara, J. Norambuena, A. Beiza, F. Maza, P. Ubilla, I. Araya, Renato Chávez, Aurelio San-Martín, José Darias, María J. Darias, Inmaculada Vaca. 2013. Diversity of cultivable fungi associated with Antarctic marine sponges and screening for their antimicrobial, antitumoral and antioxidant potential. World J Microbiol Biotechnol 30: 65 – 76.
Mojtaba Mohseni, Hamed Norouzi, Javad Hamedi, Aboulghasem Roohi. 2013. Screening of Antibacterial Producing Actinomycetes from Sediments of the Caspian Sea. Spring Vol 2, No 2.
Quanzi Li, Guangyi Wang. 2007. Diversity of fungal isolates from three Hawaiian marine sponges. Microbiological Research 164: 233 – 241
Raper K B, Fennell D L. 1965.. The Gennus Aspergillus, Baltimore USA William and Wilkins, Preston street baltimore. Md 21202 USA. p.570.
Robert A. Samson and Ellen S.Hoekstra, Jens C. Frisvad and Filtenborg. 1996. Introduction to Food- borne Fungi. Centraalbureau voor Schimmelcutues Baarl Delftm (3,4) 52- 83.
Sambrook J. and Russell D.W. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Shen S, Li W, Ouyang MA, Wu ZL, Lin QY, Xie LH. 2009. Identification of two
marine fungi and evaluation of their antivirus anf antiumor activities. Microbial 49: 1240 – 1246.
Shuo Shen, WeiLi, Jian Wang. 2014. Antimicrobial and antitumor activities of crude secondary metabolites from a marine fungus Penicillium Oxalicum 312F1. African Journal of Microbiology Research (Vol 8). pp. 1480 – 1485.
Thomas J. Montville & Karl R. Matthew. 2005. Food Microbiology an Introduction. Asm Press. pp 272-276.
Verschuere L., Rombaut G., Sorgeloos P. and Verstraete W. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiology & Molecular Biology Reviews Vol.64 pp. 655-671.
PHỤ LỤC 1. MÔI TRƢỜNG
1.1 Môi trƣờng Glucose Peptone Yeast Extract Agar thích hợp cho nhiều lồi nấm mốc Bảng 9: Thành phần môi trƣờng Đường D-glucose 1,0 g Peptone 0,5 g Yeast Extract 0,1 g NaCl 3 g Agar 15 g Nước biển 1 lít pH 8,0 Pha chế:
Cân hóa chất, khuấy đều đến khi hịa tan các chất. Sau đó chỉnh pH đến 8,0 ± 0,1. Bổ sung agar vào mơi trường, rót 300 mL vào mỗi bình chứa có dung tích 500 mL.
Đem khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 121oC/20 phút. Sau khi lấy ra, môi trường để nguội khoảng 45o
C ± 1oC rồi cho 300 µg mỗi loại kháng sinh (streptomycin và ampicilin) vào môi trường, lắc đều cho kháng sinh hòa tan hết rồi đổ vào các đĩa petri, mỗi đĩa 15 – 20 mL thạch.
Mở nắp đĩa để thạch đông tự nhiên, bật UV 15 phút sau đó đóng nắp, lật ngược đĩa cho vào túi nylong buộc chặt, bảo quản ở nhiệt độ phịng khơng quá 10 ngày.
1.2 Môi trƣờng GAUSE 1 Bảng 10: Thành phần môi trƣờng Tinh bột 20 g KNO3 1 g K2HPO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,5 g
NaCl 0,5g FeSO4 0,01g Difco-Bacto agar 15g pH 7,2 – 7,4 1.3 Môi trƣờng LB Bảng 11: Thành phần môi trƣờng Tryptone 10g Yeast Extract 5g Sodium chloride 10g Agar 7g pH 7.2
(*Nguồn: Sambrook and Russell, 2001, Gerhardt et a., 1994)
1.4 Môi trƣờng LB lỏng Bảng 12: Thành phần môi trƣờng Tryptone 10g Yeast Extract 5g NaCl 10g pH 7,2
2. Hình đại thể, vi thể của các dịng nấm mốc phân lập đƣợc
3.
Hình 26: Bào tử và cọng bào tử dòng GL3
Hình 27: Cuống bào tử dịng GL3
Hình 29: Bào tử và khuẩn ty dịng GL5
Hình 30: Cọng bào tử dịng GL5
Hình 32: Cọng bào tử dịng L1
Hình 34: Cọng bào tử và thể bình dịng L2
Hình 35: Cọng bào tử và thể bình dịng L2
Hình 37: Khuẩn ty dịng L5
Hình 38: Cọng bào tử và bào tử dòng L5
\
3. Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính kháng sinh của nấm mốc
Nuôi vi sinh vật kiểm định (VSV kiểm định):
Chuẩn bị môi trường LB lỏng trong các ống nghiệm 10 mL, hấp khử trùng ở 121oC/20 phút. Để môi trường nguội tự nhiên, sau đó cấy ni tăng sinh vi sinh vật kiểm định, ủ 24 ÷ 72 và 28oC ÷ 30oC (thích hợp với từng loại vi sinh vật).
Thử hoạt tính kháng sinh:
Trên đĩa thạch LB được pha chế bằng nước cất, dùng micropipet hút 100 µL dịch nuôi tăng sinh VSV kiểm định, trãi đều bằng que cấy. Mỗi dòng nấm cần thử nghiệm trên 7 loại VSV kiểm định, mỗi đĩa thạch đã trải VSV kiểm định thử nghiệm được bốn dòng khác nhau.
Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn ty và bào tử nấm mốc (bao gồm một ít thạch) cấy trực tiếp vào đĩa đã trãi VSV kiểm định, ủ 24 ÷ 48 giờ ở nhiệt độ 28oC ÷ 30oC thích hợp cho từng loại VSV kiểm định.
Sau đó quan sát và ghi nhận kết quả các dòng nấm tạo vịng vơ khuẩn (+), tiến hành đo đạc đường kính vịng vơ khuẩn.
4. Hình ảnh các dịng nấm tạo vịng vơ khuẩn trên các VSV kiểm định