3.2.2.2 Phương pháp phân lập
Phân lập theo phương pháp pha loãng mẫu và phương pháp sử dụng kim nhọn nhặt bào tử.
Chuẩn bị môi trƣờng:
Môi trường nuôi cấy, nước biển, ống nghiệm và các dụng cụ xử lí mẫu được hấp khử trùng (121oC/20 phút).
Chuẩn bị mẫu:
Mẫu được cắt nhỏ và nghiền nát bằng đũa thủy tinh cho đến khi nhìn thấy được dung dịch đồng nhất, để yên 30 phút sau đó trãi mẫu.
Chuẩn bị dung dịch mẫu:
Dùng micropipet hút 1 mL dung dịch mẫu đã Vortex đều sang ống nghiệm chứa sẵn 9 mL nước biển. Lắc đều trong 2 ÷ 3 phút, thu được dung dịch mẫu.
Phƣơng pháp tiến hành:
Bước 1: Ni cấy mẫu
Ghi kí hiệu mẫu và nồng độ dung dịch mẫu lên đĩa petri.
Dùng micropipet hút 100 µL dung dịch mẫu cho vào giữa mỗi đĩa thạch, dùng que trang trãi đều dịch mẫu lên bề mặt mơi trường. Mỗi mẫu ni cấy ít nhất trên 3 đĩa thạch và thay đầu col vô trùng riêng.
Đem các đĩa thạch đã trãi mẫu ủ ở 30o
C từ 1 ÷ 3 tuần. Khơng lật ngược các đĩa.
Bước 2: Cấy ròng
Chọn các đĩa có khuẩn lạc nấm mốc, dùng kim cấy có mũi nhọn cấy một ít bào tử sang đĩa thạch mới, ủ 30oC trong 3 ÷ 7 ngày, khơng lật ngược các đĩa
Sau khi cấy chuyển các khuẩn lạc đồng nhất thì tiến hành cấy điểm để nhận diện đặc điểm khuẩn lạc, sau đó chuyển sang mơi trường thạch nghiêng để trữ mẫu.
Ủ ở nhiệt độ phịng từ 3 ÷ 7 ngày. Chờ khuẩn lạc riêng lẻ cấy chuyền sang ống nghiệm thạch nghiêng.
Làm thuần: Lấy 1 mẫu khuẩn lạc trong ống thạch nghiêng, hịa vào nước vơ trùng, trải lên đĩa lần thứ 2, nếu thuần nhất 1 khuẩn lạc đồng đều, màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển vi đều có dạng tế bào đã thuần, ta cấy sang ba ống thạch nghiêng để bảo quản ngắn hạn và thử khả năng sinh hoạt chất đối kháng của nấm sợi..
Bước 3: Quan sát
Sau khi quan sát, các dòng nấm mốc đã ròng được cấy vào 2 ống nghiệm, trữ giống tạm thời trong tủ lạnh khoảng 4oC.
3.2.2.3 Quan sát khuẩn lạc
Phương pháp nuôi cấy tạo khuẩn lạc khổng lồ
Cho vào ống thạch nghiêng (đã cấy dòng nấm sợi thuần khiết) 5ml nước cất, tạo dung dịch huyền phù. Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa đĩa petri.
Khi các dòng nấm đã hình thành bào tử, tiến hành nhận xét đặc điểm đại thể, vi thể.
Đại thể: bằng mắt thường, hay dùng kính lúp cầm tay, nhận xét về kích thước, màu sắc… của khuẩn lạc nấm.
Quan sát sự hình thành và phát triển của khuẩn lạc hàng ngày theo các đặc điểm sau:
- Đo kích thước khuẩn lạc - Quan sát hình dạng khuẩn lạc
Theo Nguyễn Liên Hoa et al., (2006), các đặc điểm hình thái nấm mốc cần quan
sát gồm:
+ Hình dạng (trịn, gần trịn…)
+ Kích thước (đường kính trung bình của khuẩn lạc) + Dạng mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt,…) + Màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới.
+ Dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, nhăn nheo,…) + Độ nổi (nhô, phẳng,…)
+ Mật số bào tử (nếu có) + Giọt tiết (nếu có).
(ii) Quan sát vi thể nấm sợi
Vi thể: Để nhận xét đặc điểm vi thể của nấm mốc phải làm tiêu bản nấm mốc, rồi quan sát hình thái học dưới kính hiển vi ở vật kính x10, x40.
Làm tiêu bản nấm mốc: Lấy một lam kính sạch, trong, đã sấy khô. Dùng micropipet nhỏ một giọt nước cất lên lam kính. Dùng kim cấy hay kẹp tay lấy tồn bộ hình thái nấm (từ tế bào chân, khuẩn ty đến hạt đính). Sau đó trải đều lên lam kính, đậy lame từ từ sau cho khơng có bọt khí, quan sát dưới kính hiển vi.
Quan sát hình dạng bào tử
+ Hình dạng cuống bào tử (bào tử túi, bào tử đính, bào tử đốt) + Hình dạng bào tử (trịn, gần tròn, oval,…)
Quan sát hình dạng khuẩn ty. + Đo kích thước sợi nấm
+ Đặc điểm: có hoặc khơng có vách
3.2.3 Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của nấm sợi
Thử khả năng sinh hoạt chất đối kháng của nấm sợi
3.2.3.1 Nguyên tắc
Nếu các dòng nấm mốc trên khối thạch có khả năng hình thành hoạt chất đối kháng thì chúng sẽ ức chế tiêu diệt các vi sinh vật kiểm định và tạo thành vịng vơ khuẩn (halo) xung quanh khối thạch.
3.2.3.2 Tiến hành thí nghiệm:
- Phương pháp khối thạch (Egorov, 1983)
Chuẩn bị các dòng nấm sợi nghiên cứu và các mơi trường thích hợp. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch nấm mốc cần thử hoạt tính đối kháng. Đặt các khối thạch vào đĩa petri có mơi trường đã trãi đều các vi sinh vật kiểm định.
3.2.3.2 Kiểm tra kết quả
Hoạt tính kháng khuẩn = (D – d) mm
Với D = đường kính vịng phân giải, d = đường kính khuẩn lạc (khối/ lổ thạch) - (D – d) ≥ 25mm : hoạt tính rất mạnh - (D – d) ≥ 20mm : hoạt tính mạnh - (D – d) ≥ 10–19,5mm: hoạt tính trung bình - (D – d) ≤ 10mm: hoạt tính yếu. 3.3 SƠ TUYỂN NẤM MỐC Chọn những dịng nấm mốc có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và rất mạnh.
CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập các dòng nấm mốc từ hải miên. 4.1 Kết quả phân lập các dòng nấm mốc từ hải miên.
4.1.1 Kết quả phân lập từ các mẫu ở hải miên
Đầu tiên tạo mơi trường thích hợp để phân lập nấm mốc trên hải miên phát triển. Môi trường GPY, G1, LB có bổ sung kháng sinh nhằm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn. Từ 23 mẫu hải miên, qua quá trình phân lập, dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc đã xác định được 33 dịng, trong đó có 5 dịng có nguồn gốc từ hải miên ở Hòn Kiến Vàng, (được ký hiệu là V1, V2,…), 22 dịng có nguồn gốc từ hải miên ở Hòn Rễ Lớn (ký hiệu là L1, L2…), 1 dịng có nguồn gốc từ hải miên ở Hịn Rễ Nhỏ (ký hiệu là N1) và có 5 dịng có nguồn gốc từ hải miên ở Hòn Núi Đèn (ký hiệu D1, D2…). Kết quả được ghi nhận ở Bảng 4.
Bảng 4: Nấm mốc phân lập từ hải miên
Nguồn phân lập Số mẫu phân lập Số chủng nấm mốc
Hòn Núi Đèn Hòn Rễ Lớn Hòn Rễ Nhỏ Hòn Kiến Vàng 6 6 8 3 5 22 1 5 Tổng số 23 33
Từ kết quả tổng hợp ở bảng cho thấy, hải miên ở Hịn Rễ Lớn có sự hiện diện của các dòng nấm mốc nhiều hơn ở Hòn Rễ Nhỏ, Hòn Núi Đèn và Hịn Kiến Vàng. Sau đó tiến hành quan sát hình thái nấm, đo kích thước khuẩn lạc.
4.1.2 Kết quả quan sát khuẩn lạc
Nhìn chung các dòng nấm phân lập được có khuẩn lạc hình trịn, hoặc gần trịn, mép hình tia, bào tử có màu sắc đa dạng màu đen, nâu đen, vàng hay xanh rêu, xanh lá, có dạng mặt nhung mịn, len xốp và dạng hạt, kích thước khuẩn lạc trung bình 20 ÷ 70 mm, bề mặt khuẩn lạc hơi mô.