5.1 Kết luận
Kết quả đề tài đã phân lập được 33 dòng nấm mốc từ 23 mẫu Hải miên vùng biển Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang. Mô tả sơ bộ đặc điểm đại thể và đặc điểm vi thể của các dòng nấm trên môi trường Glucose Peptone Yeast Extract Agar (GPY), Gause 1, Luria Bertani Agar (LB) về kích thước, cấu trúc, màu sắc khuẩn lạc và đặc điểm của bào tử...
Bằng phương pháp khối thạch, dựa vào đường kính vịng vơ khuẩn đã thu được 9/33 dòng nấm mốc có khả năng kháng khuẩn cao, dựa trên đường kính vịng vơ khuẩn > 20 mm, bao gồm 7 dòng từ hải miên có nguồn gốc ở Hòn Rễ Lớn, ký hiệu là GL2 (25 mm), GL5 (23 mm), GL3 (20 mm), L1 (20 mm), L10 (20 mm), YL1 (20 mm) và YL4 (20 mm); 1 dòng từ Hòn Núi Đèn, ký hiệu là LD1 (24 mm); 1 dòng từ Hòn Kiến Vàng, ký hiệu là LV3 (20 mm).
Nhìn chung các dịng nấm có hoạt tính kháng khuẩn cao có khuẩn lạc hình trịn hay gần trịn, mép hình tia, bào tử có màu đen, nâu đen, nâu vàng, có dạng mặt nhung mịn, hạt đen mỏng hay dày, kích thước khuẩn lạc trung bình 50 ÷ 60 mm, bề mặt khuẩn lạc hơi mô. Tất cả 7 dòng nấm khuẩn ty đều có vách, phân nhánh, không màu hay màu nhạt, sinh sản bằng bào tử đính, bào tử có hình trịn, gần trịn hay oval, thể bình lớn. Nhận xét các đặc điểm đại thể và vi thể định danh sơ bộ ban đầu các dịng nấm có hoạt tính kháng khuẩn cao thuộc Chi nấm Aspergillus.
5.2 Kiến nghị
Tiếp tục thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn các dòng nấm phân lập được trên các dòng vi sinh vật kiểm định khác.
Nghiên cứu phương pháp tinh sạch làm tăng hoạt tính kháng khuẩn và các ứng dụng từ các dòng nấm mốc trên.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Bùi Xuân Đồng (2004). Nguyên lý phòng chống nấm mốc & mycotoxin. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành (2010). Giáo trình Nấm học.
Đặng Vũ Hồng Miên (1999). Bảng phân loại các loài nấm mốc thường gặp. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Lê Xuân Phương (2001). Vi sinh vật công nghiệp. NXB Xây dựng ĐH Đà Nẵng. Lương Đức Phẩm (2007). Công nghệ vi sinh vật. NXB Nông Nghiệp.
Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1978). Vi sinh tổng hợp. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội
Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn (2001). Thực tập vi sinh vật học. Trường Đại học Kỹ Thuật Thành phố Hồ Chí Minh.
Nguyễn Lân Dũng (1983). Một số sản phẩm của vi nấm. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998). Vi sinh vật học. NXB Giáo Dục.
Nguyễn Lân Dũng. Vi sinh vật tổng hợp. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Nguyễn Thành Đạt (2005). Cơ sở sinh học vi sinh vật. Tập 1,2. NXB Y học, Hà Nội. Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Như Thành, Dương Đức Tiến (2004). Vi sinh vật nông
nghiệp. NXB Đại học Sư Phạm.
Trần Thị Thanh (2007). Công nghệ vi sinh. NXB Giáo Dục.
Tiếng anh
Bo Ding, Ying Yin, Fengli Zhang, Zhiyong Li. 2009. Recovery and Phylogenetic Diversity of Culturable Fungi Associated with Marine Sponge Clathrina luteoculcitella and Holoxea sp. in the South China Sea. Mar Biotechnol 13: 713 – 721.
Bhat KM, Hay AJ, Claeyssens M, Wood TM. 1990. Study of the mode of action and site-specificity of the endo-(1-4)-beta-D-glucanases of the fungus Penicillium
pinophilum with normal, 1-3H-labelled, reduced and chromogenic cello oligosaccharides. Biochem J 266: 371-378.
Blehert DS, Hicks AC, Behr M, Meteyer CU, Berlowski-Zier BM, Buckles EL, Coloman JT, Darling SR, Gargas A, Niver R, Okoniewski JC, Rudd RJ, Stone WB. 2009. Science 227 – 323.
Blunt JW, Copp BR, Hu WP, Munro MH, Northcote PT, Prinsep MR. 2007. Marine natural products. Nat Prod Rep 24: 31 – 86.
Bridge PD, Newsham KK. 2009. Soil fungal community composition at Mars Oasis, a southern maritime Antarctic site, assessed by PCR amplification and cloning. Fungal Ecol 2: 66 – 74.
Bugni PS, Ireland CM. 2004. Marine-derived fungi: a chemically and biologically diverse group of microorganisms. Nat Prod Rep 21: 143 – 163.
Chen BE, Zhang SL. 2006. Antimicrobial characteristics of marine fungi Aspergillus sp. MF 134. J. Huaqiao Univ 27: 307 – 309.
Coker PS, Radecke J, Guy C, Camper ND. 2003. Potato disc tumor induction assay: a multiple mode of drug action assay. Phytomed 10: 133 – 138.
Coral G, Burhan A, Unaldi M, Guvenmez H. 2002. Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type strain. Turk J Biol 26: 209-213.
Dahot M, Noomrio M. 1996. Microbial production of cellulase by Aspergillus fumigatus using wheat straw as a carbon sourc., J Islamic Acad Sci 9: 119 -124. Frisvad JC, Samson RA. 2004. Polyphasic taxonomy of Penicillium subgenus
Penicillium: A guide to identification of food and air-borne terverticillate Penicillia ans their mycotoxins. Stud Mycol 49: 1 – 174.
Gao Q, Yang ZL. 2010. Ectomycorrhizal fungi associated with two species of Kobresia in an alpine meadow in the eastern Himalaya. Mycorrhiza 20: 281 – 287.
Gao Z, Li B, Zheng C, Wang G. 2008. Molecular detection of fungal commu in the Hawaiian marine sponges Suberites zeteki and Mycale armata. Appl Environ Microbiol 74: 6091 – 6101.
Grasso S, Bruni V, Maio G. 1997. Marine fungi in Terra Nova Bay. New Microbiol 20: 371 – 376.
Han XX, Xu XY, Cui CB, Gu QQ. 2007. Diketopiperazines produced by marine- derived Aspergillus fumigatus H1-04 anf their antiumor activities. Chin. I. Med. Chem. 17: 155 – 159.
Jan Vicente, Allison Stewart, Bongkeun Song, Russell T. Hill, Jeffrey L. Wright. 2012. Biodiversity of Actinomycetes Associated with Caribbean Sponges and Their Potential for Natural Product Discovery. Mar Biotechnol 15: 413 – 424. Jutta Wiese. 2011. Phylogenetic Identification of Fungi Isolated from the Marine
Sponge Tethya aurantium and Identification of Their Secondary Metabolites. Mar. Durgus 9: 561 – 585.
Li CS, Li XM, Gao SS, Lu YH, Wang BG. 2013. Cytotoxic anthranilic acid derivatives from deep sea sedimet-derived fungus Penicillium paneum SD-44. Mar. Drugs 11: 3068 – 3076.
Li Q, Wang G. 2009. Diversity of fungal isolates from three Hawaiin marine sponges. Microbiol Res 164: 231 – 235.
Liu WC, Li CQ, Zhu P, Yang JL, heng KD. 2010. Phylogenetic diversity of culturable fungi associated with two marine sponges: Haliclona simulans and Gelliodes carnosa, collected from the Hainan Island coastal waters of the South China Sea. Fungal Div 42: 1 – 15.
Marlene Heríquez, Karen Vgara, J. Norambuena, A. Beiza, F. Maza, P. Ubilla, I. Araya, Renato Chávez, Aurelio San-Martín, José Darias, María J. Darias, Inmaculada Vaca. 2013. Diversity of cultivable fungi associated with Antarctic marine sponges and screening for their antimicrobial, antitumoral and antioxidant potential. World J Microbiol Biotechnol 30: 65 – 76.
Mojtaba Mohseni, Hamed Norouzi, Javad Hamedi, Aboulghasem Roohi. 2013. Screening of Antibacterial Producing Actinomycetes from Sediments of the Caspian Sea. Spring Vol 2, No 2.
Quanzi Li, Guangyi Wang. 2007. Diversity of fungal isolates from three Hawaiian marine sponges. Microbiological Research 164: 233 – 241
Raper K B, Fennell D L. 1965.. The Gennus Aspergillus, Baltimore USA William and Wilkins, Preston street baltimore. Md 21202 USA. p.570.
Robert A. Samson and Ellen S.Hoekstra, Jens C. Frisvad and Filtenborg. 1996. Introduction to Food- borne Fungi. Centraalbureau voor Schimmelcutues Baarl Delftm (3,4) 52- 83.
Sambrook J. and Russell D.W. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Shen S, Li W, Ouyang MA, Wu ZL, Lin QY, Xie LH. 2009. Identification of two
marine fungi and evaluation of their antivirus anf antiumor activities. Microbial 49: 1240 – 1246.
Shuo Shen, WeiLi, Jian Wang. 2014. Antimicrobial and antitumor activities of crude secondary metabolites from a marine fungus Penicillium Oxalicum 312F1. African Journal of Microbiology Research (Vol 8). pp. 1480 – 1485.
Thomas J. Montville & Karl R. Matthew. 2005. Food Microbiology an Introduction. Asm Press. pp 272-276.
Verschuere L., Rombaut G., Sorgeloos P. and Verstraete W. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiology & Molecular Biology Reviews Vol.64 pp. 655-671.
PHỤ LỤC 1. MƠI TRƢỜNG
1.1 Mơi trƣờng Glucose Peptone Yeast Extract Agar thích hợp cho nhiều lồi nấm mốc Bảng 9: Thành phần môi trƣờng Đường D-glucose 1,0 g Peptone 0,5 g Yeast Extract 0,1 g NaCl 3 g Agar 15 g Nước biển 1 lít pH 8,0 Pha chế:
Cân hóa chất, khuấy đều đến khi hịa tan các chất. Sau đó chỉnh pH đến 8,0 ± 0,1. Bổ sung agar vào mơi trường, rót 300 mL vào mỗi bình chứa có dung tích 500 mL.
Đem khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 121oC/20 phút. Sau khi lấy ra, môi trường để nguội khoảng 45o
C ± 1oC rồi cho 300 µg mỗi loại kháng sinh (streptomycin và ampicilin) vào môi trường, lắc đều cho kháng sinh hòa tan hết rồi đổ vào các đĩa petri, mỗi đĩa 15 – 20 mL thạch.
Mở nắp đĩa để thạch đông tự nhiên, bật UV 15 phút sau đó đóng nắp, lật ngược đĩa cho vào túi nylong buộc chặt, bảo quản ở nhiệt độ phịng khơng quá 10 ngày.
1.2 Môi trƣờng GAUSE 1 Bảng 10: Thành phần môi trƣờng Tinh bột 20 g KNO3 1 g K2HPO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,5 g
NaCl 0,5g FeSO4 0,01g Difco-Bacto agar 15g pH 7,2 – 7,4 1.3 Môi trƣờng LB Bảng 11: Thành phần môi trƣờng Tryptone 10g Yeast Extract 5g Sodium chloride 10g Agar 7g pH 7.2
(*Nguồn: Sambrook and Russell, 2001, Gerhardt et a., 1994)
1.4 Môi trƣờng LB lỏng Bảng 12: Thành phần môi trƣờng Tryptone 10g Yeast Extract 5g NaCl 10g pH 7,2
2. Hình đại thể, vi thể của các dòng nấm mốc phân lập đƣợc
3.
Hình 26: Bào tử và cọng bào tử dịng GL3
Hình 27: Cuống bào tử dịng GL3
Hình 29: Bào tử và khuẩn ty dịng GL5
Hình 30: Cọng bào tử dịng GL5
Hình 32: Cọng bào tử dịng L1
Hình 34: Cọng bào tử và thể bình dịng L2
Hình 35: Cọng bào tử và thể bình dịng L2
Hình 37: Khuẩn ty dịng L5
Hình 38: Cọng bào tử và bào tử dòng L5
\
3. Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính kháng sinh của nấm mốc
Nuôi vi sinh vật kiểm định (VSV kiểm định):
Chuẩn bị môi trường LB lỏng trong các ống nghiệm 10 mL, hấp khử trùng ở 121oC/20 phút. Để môi trường nguội tự nhiên, sau đó cấy ni tăng sinh vi sinh vật kiểm định, ủ 24 ÷ 72 và 28oC ÷ 30oC (thích hợp với từng loại vi sinh vật).
Thử hoạt tính kháng sinh:
Trên đĩa thạch LB được pha chế bằng nước cất, dùng micropipet hút 100 µL dịch ni tăng sinh VSV kiểm định, trãi đều bằng que cấy. Mỗi dòng nấm cần thử nghiệm trên 7 loại VSV kiểm định, mỗi đĩa thạch đã trải VSV kiểm định thử nghiệm được bốn dòng khác nhau.
Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn ty và bào tử nấm mốc (bao gồm một ít thạch) cấy trực tiếp vào đĩa đã trãi VSV kiểm định, ủ 24 ÷ 48 giờ ở nhiệt độ 28oC ÷ 30oC thích hợp cho từng loại VSV kiểm định.
Sau đó quan sát và ghi nhận kết quả các dòng nấm tạo vịng vơ khuẩn (+), tiến hành đo đạc đường kính vịng vơ khuẩn.
4. Hình ảnh các dịng nấm tạo vịng vơ khuẩn trên các VSV kiểm định
Hình 40: Các dịng nấm mốc 1 – GV1 (9 mm) ; 2 – GL5 (19 mm); 3 – GL2 (20 mm); 4 – GL4 ( – ) tạo vịng vơ khuẩn ở vi khuẩn Edwarsiella ictaluri chủng 2
Hình 41: Các dịng nấm mốc 1 – LV2 (–); 2 – L9 (8 mm); 3 – L8 (–); 4 – GL1 (–) tạo vịng vơ khuẩn ở vi khuẩn Salmonella enterica
Hình 42: Các dịng nấm mốc 1 – YL1 (20 mm); 2 – YD2 (18 mm); 3 – YL4 (20 mm); 4 – YL5 ( 18 mm) tạo vịng vơ khuẩn ở vi khuẩn Salmonella enterica
Hình 43: Các dịng nấm mốc 1 – L1 (19 mm); 2 – LD1 (20 mm); 3 – LV3 (–); 4 – L10 (19 mm) tạo vịng vơ khuẩn ở vi khuẩn Candida albicans
Hình 44: Các dịng nấm mốc 1 – YD3 (10 mm); 2 – L5 (18 mm); 3 – GD1 (–); 4 – L7 (–) tạo vịng vơ khuẩn ở vi khuẩn Candida albicans
Hình 45: Các dịng nấm mốc 1 – YV1 (17 mm) ; 2 – YD1 (15 mm); 3 – YL6 (15 mm); 4 – YL3 ( 14 mm) tạo vịng vơ khuẩn ở vi khuẩn Salmonella enterica