CHƢƠNG III : PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Môi trƣờng
Bảng 1: Môi trƣờng Glucose Peptone Yeast Extract Agar (GPY) Hóa chất Nồng độ (g/l) Đường D-glucose 1,0 g Peptone 0,5 g Yeast Extract 0,1 g NaCl 3 g Agar 15 g Nước biển 1 lít pH 8,0
(*Nguồn: Quanzi Li, Guangyi Wang (2009)).)
Bảng 2: Mơi trƣờng Gause 1 Hóa chất Nồng độ (g/l) Tinh bột 20 g KNO3 1 g K2HPO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,5 g NaCl 0,5g FeSO4 0,01g Difco-Bacto agar 15g pH 7,2 – 7,4
(*Nguồn: Quanzi Li, Guangyi Wang (2009)).)
Bảng 3: Môi trƣờng Luria Bertani Agar (LB) Hóa chất Nồng độ (g/l) Tryptone 10g Yeast Extract 5g NaCl 10g Agar 7g Ph 7.2
(*Nguồn: Quanzi Li, Guangyi Wang (2009)).
Bổ sung vào môi trường kháng sinh Ampicillin và Streptomycin (100 mg/ml).
3.2.2 Phân lập nấm mốc
Mục đích: Phân lập được những dòng nấm mốc từ hải miên ở vùng biển Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang.
3.2.2.1 Thu mẫu
Mẫu được thu bằng tay ở độ sâu 0,5m so với mực nước biển, mẫu được bảo quản bên trong bọc nylong dã có đánh dấu ký hiệu mẫu. Sau đó được trữ lạnh trong nước đá và vận chuyển về phịng thí nghiệm. Sau khi đến phịng thí nghiệm mẫu tiếp tục được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 0 ÷ 5oC.
Hình 11: Mẫu hải miên
3.2.2.2 Phương pháp phân lập
Phân lập theo phương pháp pha loãng mẫu và phương pháp sử dụng kim nhọn nhặt bào tử.
Chuẩn bị môi trƣờng:
Môi trường nuôi cấy, nước biển, ống nghiệm và các dụng cụ xử lí mẫu được hấp khử trùng (121oC/20 phút).
Chuẩn bị mẫu:
Mẫu được cắt nhỏ và nghiền nát bằng đũa thủy tinh cho đến khi nhìn thấy được dung dịch đồng nhất, để yên 30 phút sau đó trãi mẫu.
Chuẩn bị dung dịch mẫu:
Dùng micropipet hút 1 mL dung dịch mẫu đã Vortex đều sang ống nghiệm chứa sẵn 9 mL nước biển. Lắc đều trong 2 ÷ 3 phút, thu được dung dịch mẫu.
Phƣơng pháp tiến hành:
Bước 1: Ni cấy mẫu
Ghi kí hiệu mẫu và nồng độ dung dịch mẫu lên đĩa petri.
Dùng micropipet hút 100 µL dung dịch mẫu cho vào giữa mỗi đĩa thạch, dùng que trang trãi đều dịch mẫu lên bề mặt mơi trường. Mỗi mẫu ni cấy ít nhất trên 3 đĩa thạch và thay đầu col vô trùng riêng.
Đem các đĩa thạch đã trãi mẫu ủ ở 30o
C từ 1 ÷ 3 tuần. Khơng lật ngược các đĩa.
Bước 2: Cấy ròng
Chọn các đĩa có khuẩn lạc nấm mốc, dùng kim cấy có mũi nhọn cấy một ít bào tử sang đĩa thạch mới, ủ 30oC trong 3 ÷ 7 ngày, khơng lật ngược các đĩa
Sau khi cấy chuyển các khuẩn lạc đồng nhất thì tiến hành cấy điểm để nhận diện đặc điểm khuẩn lạc, sau đó chuyển sang mơi trường thạch nghiêng để trữ mẫu.
Ủ ở nhiệt độ phịng từ 3 ÷ 7 ngày. Chờ khuẩn lạc riêng lẻ cấy chuyền sang ống nghiệm thạch nghiêng.
Làm thuần: Lấy 1 mẫu khuẩn lạc trong ống thạch nghiêng, hịa vào nước vơ trùng, trải lên đĩa lần thứ 2, nếu thuần nhất 1 khuẩn lạc đồng đều, màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển vi đều có dạng tế bào đã thuần, ta cấy sang ba ống thạch nghiêng để bảo quản ngắn hạn và thử khả năng sinh hoạt chất đối kháng của nấm sợi..
Bước 3: Quan sát
Sau khi quan sát, các dòng nấm mốc đã ròng được cấy vào 2 ống nghiệm, trữ giống tạm thời trong tủ lạnh khoảng 4oC.
3.2.2.3 Quan sát khuẩn lạc
Phương pháp nuôi cấy tạo khuẩn lạc khổng lồ
Cho vào ống thạch nghiêng (đã cấy dòng nấm sợi thuần khiết) 5ml nước cất, tạo dung dịch huyền phù. Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa đĩa petri.
Khi các dịng nấm đã hình thành bào tử, tiến hành nhận xét đặc điểm đại thể, vi thể.
Đại thể: bằng mắt thường, hay dùng kính lúp cầm tay, nhận xét về kích thước, màu sắc… của khuẩn lạc nấm.
Quan sát sự hình thành và phát triển của khuẩn lạc hàng ngày theo các đặc điểm sau:
- Đo kích thước khuẩn lạc - Quan sát hình dạng khuẩn lạc
Theo Nguyễn Liên Hoa et al., (2006), các đặc điểm hình thái nấm mốc cần quan
sát gồm:
+ Hình dạng (trịn, gần trịn…)
+ Kích thước (đường kính trung bình của khuẩn lạc) + Dạng mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt,…) + Màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới.
+ Dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, nhăn nheo,…) + Độ nổi (nhô, phẳng,…)
+ Mật số bào tử (nếu có) + Giọt tiết (nếu có).
(ii) Quan sát vi thể nấm sợi
Vi thể: Để nhận xét đặc điểm vi thể của nấm mốc phải làm tiêu bản nấm mốc, rồi quan sát hình thái học dưới kính hiển vi ở vật kính x10, x40.
Làm tiêu bản nấm mốc: Lấy một lam kính sạch, trong, đã sấy khô. Dùng micropipet nhỏ một giọt nước cất lên lam kính. Dùng kim cấy hay kẹp tay lấy tồn bộ hình thái nấm (từ tế bào chân, khuẩn ty đến hạt đính). Sau đó trải đều lên lam kính, đậy lame từ từ sau cho khơng có bọt khí, quan sát dưới kính hiển vi.
Quan sát hình dạng bào tử
+ Hình dạng cuống bào tử (bào tử túi, bào tử đính, bào tử đốt) + Hình dạng bào tử (trịn, gần tròn, oval,…)
Quan sát hình dạng khuẩn ty. + Đo kích thước sợi nấm
+ Đặc điểm: có hoặc khơng có vách
3.2.3 Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của nấm sợi
Thử khả năng sinh hoạt chất đối kháng của nấm sợi
3.2.3.1 Nguyên tắc
Nếu các dòng nấm mốc trên khối thạch có khả năng hình thành hoạt chất đối kháng thì chúng sẽ ức chế tiêu diệt các vi sinh vật kiểm định và tạo thành vịng vơ khuẩn (halo) xung quanh khối thạch.
3.2.3.2 Tiến hành thí nghiệm:
- Phương pháp khối thạch (Egorov, 1983)
Chuẩn bị các dòng nấm sợi nghiên cứu và các mơi trường thích hợp. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch nấm mốc cần thử hoạt tính đối kháng. Đặt các khối thạch vào đĩa petri có mơi trường đã trãi đều các vi sinh vật kiểm định.
3.2.3.2 Kiểm tra kết quả
Hoạt tính kháng khuẩn = (D – d) mm
Với D = đường kính vịng phân giải, d = đường kính khuẩn lạc (khối/ lổ thạch) - (D – d) ≥ 25mm : hoạt tính rất mạnh - (D – d) ≥ 20mm : hoạt tính mạnh - (D – d) ≥ 10–19,5mm: hoạt tính trung bình - (D – d) ≤ 10mm: hoạt tính yếu. 3.3 SƠ TUYỂN NẤM MỐC Chọn những dịng nấm mốc có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và rất mạnh.
CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập các dòng nấm mốc từ hải miên. 4.1 Kết quả phân lập các dòng nấm mốc từ hải miên.
4.1.1 Kết quả phân lập từ các mẫu ở hải miên
Đầu tiên tạo mơi trường thích hợp để phân lập nấm mốc trên hải miên phát triển. Môi trường GPY, G1, LB có bổ sung kháng sinh nhằm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn. Từ 23 mẫu hải miên, qua quá trình phân lập, dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc đã xác định được 33 dịng, trong đó có 5 dịng có nguồn gốc từ hải miên ở Hòn Kiến Vàng, (được ký hiệu là V1, V2,…), 22 dịng có nguồn gốc từ hải miên ở Hòn Rễ Lớn (ký hiệu là L1, L2…), 1 dịng có nguồn gốc từ hải miên ở Hòn Rễ Nhỏ (ký hiệu là N1) và có 5 dịng có nguồn gốc từ hải miên ở Hòn Núi Đèn (ký hiệu D1, D2…). Kết quả được ghi nhận ở Bảng 4.
Bảng 4: Nấm mốc phân lập từ hải miên
Nguồn phân lập Số mẫu phân lập Số chủng nấm mốc
Hòn Núi Đèn Hòn Rễ Lớn Hòn Rễ Nhỏ Hòn Kiến Vàng 6 6 8 3 5 22 1 5 Tổng số 23 33
Từ kết quả tổng hợp ở bảng cho thấy, hải miên ở Hịn Rễ Lớn có sự hiện diện của các dòng nấm mốc nhiều hơn ở Hòn Rễ Nhỏ, Hòn Núi Đèn và Hịn Kiến Vàng. Sau đó tiến hành quan sát hình thái nấm, đo kích thước khuẩn lạc.
4.1.2 Kết quả quan sát khuẩn lạc
Nhìn chung các dòng nấm phân lập được có khuẩn lạc hình trịn, hoặc gần tròn, mép hình tia, bào tử có màu sắc đa dạng màu đen, nâu đen, vàng hay xanh rêu, xanh lá, có dạng mặt nhung mịn, len xốp và dạng hạt, kích thước khuẩn lạc trung bình 20 ÷ 70 mm, bề mặt khuẩn lạc hơi mơ.
Hình 12: Khuẩn lạc dịng GL3
Hình 13: Khuẩn lạc dịng L2
Các dòng nấm mốc này sau 3 đến 7 ngày ủ được quan sát bằng mắt thường và ghi nhận trong bảng 5 như sau:
Bảng 5: Đặc điểm khuẩn lạc các dòng nấm mốc phân lập đƣợc Dịng nấm Hình dạng Hình dạng bề mặt Màu sắc mặt trên Màu sắc mặt dƣới Đƣờng kính (mm)
GL1 Trịn Nhung mịn Xanh rêu Xanh rêu 13 ÷ 23
GL2 Gần tròn Hạt đen dày Đen Trắng 60 ÷ 70
GL3 Gần tròn Hạt đen mỏng Nâu đen Trắng 70 ÷ 80
GL4 Gần tròn Hạt đen mỏng Đen Trắng 70 ÷ 80
GL5 Trịn Hạt đen mỏng Đen Trắng 60 ÷ 70
L1 Tròn Hạt đen mỏng Đen Trắng 60 ÷ 70
L2 Trịn Nhung mịn Nâu đen Trắng 40 ÷ 50
L3 Tròn Nhung mịn Đen Trắng 70 ÷ 80 L4 Gần trịn Hạt nhỏ Vàng nhạt Vàng cam 30 ÷ 40 L5 Gần tròn Len xốp Trắng kem Trắng 10 ÷ 20 L6 Gần trịn Nhung mịn Vàng nâu Vàng nhạt 40 ÷ 50 L7 Gần trịn Len xốp, có giọt tiết Trắng Vàng nhạt 10 ÷ 20 L8 Gần trịn Len xốp, có khía khơng đồng tâm Trắng đục Trắng đục 12 ÷ 22 L9 Trịn Len xốp Trắng Vàng nhạt 27 ÷ 37
L10 Gần tròn Nhung mịn Nâu đen Trắng 65 ÷ 75
YL1 Tròn Hạt đen mỏng Đen Trắng 70 ÷ 80
YL2 Gần trịn Nhung mịn Xanh rêu đậm Xanh 42 ÷ 52
YL3
Trịn Nhung mịn, có
sắc tố hịa tan. Đỏ Đỏ 10 ÷ 20
YL4 Gần trịn Nhung mịn Nâu vàng Trắng nâu 42 ÷ 52
YL5 Gần tròn Hạt đen mỏng Đen Trắng 63 ÷ 73
YL6 Trịn Nhung mịn Vàng Trắng 60 ÷ 70
GD1 Gần tròn Nhung mịn Trắng nâu Trắng 65 ÷ 75
LD1 Gần tròn Hạt đen mỏng Đen Trắng 60 ÷ 70
YD1 Trịn Hạt đen mỏng Đen Trắng 70 ÷ 80
YD2 Gần tròn Nhung mịn Đen Trắng 40 ÷ 50
YD3 Tròn Len xốp Trắng Trắng 27 ÷ 37
GV1 Gần trịn Nhung mịn Đen Trắng 30 ÷ 40
LV1 Gần tròn Len xốp Trắng kem Trắng vàng 20 ÷ 30
LV3 Tròn Hạt đen thưa Đen Trắng 50 ÷ 60 YV1 Gần tròn Hạt mịn nhỏ Màu xanh rêu Trắng xám 20 ÷ 30
LN1 Gần tròn Hạt mịn Vàng nâu Vàng nhạt 35 ÷ 45
Hình 14: Khuẩn lạc dịng L3
Hình 15: Khuẩn lạc dòng L10 4.1.3 Kết quả quan sát hiển vi
Sau khi nấm xuất hiện bào tử, làm mẫu và quan sát đặc điểm vi thể của các dịng nấm dưới kính hiển vi được ghi nhận trong bảng 6.
Bảng 6: Đặc điểm hiển vi của các dòng nấm phân lập đƣợc Dòng nấm Cọng bảo tử Hình dạng bào tử Khuẩn ty
GL1
Chuỗi Hình trứng Có vách, khơng phân nhánh, màu sậm GL2 Chùy Trịn Có vách GL3 Chùy Trịn Có vách GL4 Chùy Trịn Có vách GL5 Chùy Trịn Có vách GL6 Chuỗi Hình trứng Có vách L1 Chùy Trịn Có vách L2 Chùy Trịn Có vách L3 Chùy Trịn Có vách L4 Chùy Trịn Có vách L5
Chuỗi Trịn Có vách, khơng phân
nhánh, màu sậm L7 Túi Trịn Có vách L8 Túi Trịn Khơng có vách L10 Chùy Trịn Có vách YL1 Chùy Trịn Có vách YL2 Chùy Trịn Có vách YL3 Cọ vẽ Trịn Có vách YL4 Chùy Trịn Có vách YL5 Chùy Trịn Có vách YL6 Chuỗi Trịn Có vách LD1 Chùy Oval Có vách YD1 Chùy Trịn Có vách YD2 Túi Trịn Có vách
YD3 Cọ vẽ Trịn Khơng có vách GV1 Túi Trịn Có vách LV1 Túi Oval Có vách LV2 Túi Trịn Có vách LV3 Chùy Trịn Có vách YV1 Cọ vẽ Oval Có vách LN1 Chùy Trịn Có vách
Hình 16: Khuẩn ty và bào tử của dòng GL6
4.2 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn
4.2.1 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn
Các dòng nấm phân lập được thử nghiệm với 7 loại vi khuẩn kiểm định trong đó có Escherichia coli chủng 1, Escherichia coli chủng 2, Salmonella enterica, Bacillus cereus, Edwarsiella ictaluri chủng 1, Edwarsiella ictaluri chủng 2, Candida albicans.
Các dòng nấm phân lập được cấy trực tiếp lên môi trường đã trãi đều vi khuẩn kiểm định, sau đó đem ủ 48 giờ, quan sát và đo đường kính vịng vơ khuẩn.
Hình 18: Khuẩn ty và túi bào tử của dòng YD2
Hình 20: Vịng vơ khuẩn do dịng GL6 tạo ra trên vi khuẩn E.coli chủng 2
Hình 21: Vịng vơ khuẩn do dịng nấm L5 (phía dƣới bên trái) và dịng L10 (phía trên bên phải) tạo ra trên vi khuẩn Edwarsiella ictaluri chủng 2
Kết quả theo dõi đo đạt kích thước halo và khuẩn lạc thu được ghi nhận kết quả trong Bảng 7.
Bảng 7: Kết quả thí nghiệm theo dõi khả năng đối kháng vi sinh vật kiểm định trên mơi trƣờng LB Dịng nấm Đƣờng kính vịng vô khuẩn (mm) A E1 E2 B Ec1 Ec2 S GL2 19 18 20 9 9 - 24 GL3 20 14 18 8 7 9 20
GL4 - 10 - 8 - - 14 GL5 21 19 19 9 9 12 23 GL6 - 7 - - - - - L1 19 20 15 10 7 10 18 L2 14 10 8 - 7 7 16 L3 9 9 10 - 4 - 17 L4 17 13 15 6 10 10 18 L5 18 14 12 - 8 6 18 L6 7 5 9 - - - 6 L9 6 4 3 - - - 8 L10 19 18 15 - 7 8 20 YL1 19 15 12 12 6 7 20 YL2 7 6 14 - 6 - 8 YL3 12 12 14 - 6 6 14 YL4 17 14 11 12 - 8 20 YL5 15 12 11 10 - 9 18 YL6 15 15 - - - 9 15 LD1 20 16 15 - 10 8 25 YD1 15 13 11 7 5 8 15 YD2 16 14 12 12 7 8 18 YD3 10 7 - - - - 10 GV1 15 13 9 6 6 - 18 LV1 14 9 10 6 5 5 16 LV3 - 20 18 - 7 8 18 YV1 15 15 13 6 15 13 17 LN1 16 14 11 8 6 - 18
28 dòng 25 28 24 15 20 18 27
Chú thích:
A: Candida albicans.
E1: Edwarsiella ictaluri chủng 1. E2: Edwarsiella ictaluri chủng 2. B: Bacillus cereus.
Ec1: Escherichia coli chủng 1. Ec2: Escherichia coli chủng 2. S: Salmonella enterica.
Kết quả cho thấy các dịng nấm có khả năng tạo vịng vơ khuẩn là các dịng nấm có khả năng sản sinh các chất có khả năng kháng khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Dựa vào đường kính vịng vơ khuẩn có thể chọn ra các dòng nấm có hoạt tính kháng khuẩn mạnh.
4.2.2 Tuyển chọn các dịng nấm có khả năng tạo hoạt tính kháng khuẩn cao
Từ kết quả trong bảng 7 cho thấy, hoạt tính kháng khuẩn thu được của 28 dòng nấm mốc thơng qua đường kính vịng vơ khuẩn chọn ra 18 dịng nấm có khả năng tạo hoạt chất kháng kháng khuẩn cao được tổng hợp trong bảng 8:
Bảng 8: Các dòng nấm mốc và đƣờng kính vịng vơ khuẩn trên mơi trƣờng LB Dịng nấm Đƣờng kính (mm) Dịng nấm Đƣờng kính (mm) GL2 25 YL1 20 GL3 20 YL3 14 GL5 23 YL4 20 L1 20 LD1 24 L2 16 YD1 15 L3 17 YD2 18 L4 18 GV1 18 L5 18 LV1 16 L10 20 LV3 20
Trong đó dịng nấm mốc GL2 có đường kính vịng vơ khuẩn là 25 mm, LD1 (24 mm), GL5 (23 mm) và các dòng GL3, L1, L10, YL1, YL4, LV3 (20 mm) các dòng nấm mốc trên có đường kính lớn hơn 20 mm, rõ ràng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Các dòng nấm còn lại có đường kính halo dao động từ 14 – 18 mm có hoạt tính trung bình.
Hình 22: Các dịng nấm mốc 1 – YL3; 2 – YL6; 3 – YD1; 4 – YV1 tạo vịng vơ khuẩn ở vi khuẩn Edwarsiella ictaluri chủng 1.
Hình 23: Các dịng nấm mốc 1 – L1; 2 – LD1; 3 – LV3; 4 – L1 tạo vịng vơ khuẩn ở nấm men Candida albicans
CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 5.1 Kết luận
Kết quả đề tài đã phân lập được 33 dòng nấm mốc từ 23 mẫu Hải miên vùng biển Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang. Mô tả sơ bộ đặc điểm đại thể và đặc điểm vi thể của các dịng nấm trên mơi trường Glucose Peptone Yeast Extract Agar (GPY), Gause 1, Luria Bertani Agar (LB) về kích thước, cấu trúc, màu sắc khuẩn lạc và đặc điểm của bào tử...
Bằng phương pháp khối thạch, dựa vào đường kính vịng vơ khuẩn đã thu được 9/33 dịng nấm mốc có khả năng kháng khuẩn cao, dựa trên đường kính vịng vơ