CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu 1: Xác định đặc điểm sinh học, sinh thái học của muỗi Aedes
aegypti và Aedes albopictus tại phịng thí nghiệm.
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Muỗi, bọ gậy Ae. aegypti và Ae. albopictus tại điểm nghiên cứu. 2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Từ tháng 5/2020 đến tháng 10 năm 2021 - Địa điểm:
Tại phịng thí nghiệm: Phịng thí nghiệm Khoa Cơn trùng, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương.
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu
a) Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu phịng thí nghiệm.
b) Cỡ mẫu nghiên cứu
Tất cả mẫu muỗi, quăng, bọ gậy Aedes thu thập được tại thực địa.
c) Phương pháp chọn mẫu
Tại phịng thí nghiệm: Bọ gậy được nuôi để xác định đặc điểm sinh học. Phịng ni được cách ly với khu vực có hóa chất. Bọ gậy và muỗi được ni trong các phịng riêng. Phịng ni được duy trì nhiệt độ 26±20C, độ ẩm 80±10%.
d) Nội dung nghiên cứu
Xác định đặc điểm sinh học của muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus.
e) Phương pháp xác định biến số và đo lường biến số
- Xác định khả năng sinh sản của muỗi Aedes. - Xác định thời gian sống của muỗi Aedes.
f) Phiếu thu thập số liệu.
Phiếu ghi thơng tin
g) Các chỉ số đánh giá
- Chu kỳ vịng đời của muỗi - Tỷ lệ nở của trứng và ấu trùng - Khả năng sinh sản của muỗi - Thời gian sống của muỗi
- Hoạt động hút máu của muỗi
h) Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
- Kỹ thuật định loại muỗi, bọ gậy Aedes: Theo khóa định loại muỗi (Diptera:
Culicinae) đến giống và khóa định loại đến lồi thuộc hai giống Culex và Lutzia ở Việt Nam (2016), khóa định loại muỗi đến loài của các giống thuộc phân họ Culicinae ở Việt Nam (2019) [56], [57].
- Kỹ thuật xác định một số đặc điểm sinh học, sinh thái của muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus trong phịng thí nghiệm.
Bọ gậy Aedes thu được tại các điểm nghiên cứu được nuôi thành muỗi. Lấy trứng thế hệ F1 để xác định các đặc điểm sinh học trong phịng thí nghiệm.
* Xác định chu kỳ vịng đời muỗi Ae. aegypti. Nuôi 300 trứng muỗi Ae. aegypti vào 6 lô thử nghiệm khay men kích thước 20cmx30cmx2,5cm, mỗi lô 50 quả trứng với điều kiện trong phịng ni ở nhiệt độ 26±20C, độ ẩm 80±10%. Thức ăn của bọ gậy được lấy từ thức ăn của cá. Tiến hành theo dõi thời gian các giai đoạn: từ trứng – bọ gậy; bọ gậy -quăng; quăng – muỗi; từ khi nở thành muỗi - hút máu; từ khi hút máu - đẻ trứng.
* Xác định chu kỳ vòng đời muỗi Ae. albopictus: Thực hiện các bước tương tự
như loài muỗi Ae. aegypti.
* Xác định tỷ lệ nở, phát triển của trứng và ấu trùng Ae. aegypti.
Thả 300 trứng muỗi Ae. aegypti chia 6 lô thử nghiệm, mỗi lơ 50 quả trứng thả vào khay men kích thước 20 cm x 30 cm x 2,5 cm với điều kiện trong phịng ni, nhiệt độ 26±20C, độ ẩm 80±10%, thức ăn của bọ gậy được lấy từ thức ăn của cá. Thời gian và số lượng trứng nở được tính từ trứng đầu tiên nở thành bọ gậy tới khi 5 ngày liên tiếp khơng có trứng nở thêm thì xem như trứng khơng nở nữa. Tiếp tục theo dõi số lượng bọ gậy phát triển thành quăng và tới muỗi trưởng thành.
Tỷ lệ phát triển của các giai đoạn được tính như sau: Số lượng bọ gậy
Tỷ lệ nở của trứng (%) =---------------------------------100. Số lượng trứng theo dõi
Số lượng quăng
Tỷ lệ phát triển của bọ gậy (%) =---------------------------------100. Số lượng bọ gậy theo dõi
Số lượng muỗi
Tỷ lệ phát triển của quăng (%) =---------------------------------100. Số lượng quăng theo dõi
Số lượng muỗi
Tỷ lệ phát triển từ trứng tới muỗi (%) =------------------------------100. Tổng số trứng theo dõi
*Xác định tỷ lệ nở, phát triển của trứng và ấu trùng Ae. albopictus. Thực hiện các bước tương tự như loài muỗi Ae. aegypti.
* Xác định khả năng sinh sản của muỗi Ae. aegypti : Thả 1.500 muỗi mới nở chia thành 5 lô thử nghiệm mỗi lơ 300 cá thể vào lồng kích thước 30 cm x 30 cm x 30 cm (tỷ lệ đực/cái = 1:1). Sau 3 ngày cho muỗi đốt máu chuột bạch. Sau 5 ngày tiếp theo bắt 50 muỗi cái ngẫu nhiên trong lồng, nhốt riêng vào từng ống, theo dõi ghi lại số muỗi đẻ, số lần đẻ và số trứng đẻ của mỗi muỗi cái.
- Số lượng trứng trung bình của một muỗi cái trong cả vịng đời được tính bằng tổng số trứng thu được của quá trình sinh sản của tất cả muỗi trên tổng số muỗi theo dõi.
- Số lần đẻ trứng trung bình của một muỗi cái được tính bằng tổng số lần đẻ trứng của tất cả muỗi trên tổng số muỗi theo dõi.
Số lượng trứng trung bình của muỗi cái trong một lần đẻ được tính bằng số lượng trứng trung bình của một muỗi cái trong cả vịng đời trên số lần đẻ trứng trung bình của một muỗi cái.
* Xác định khả năng sinh sản của muỗi Ae. albopictus: Thực hiện các bước tương tự như muỗi Ae. aegypti.
* Xác định thời gian sống của muỗi Ae. aegypti: Thả 300 muỗi Ae. aegypti
mới nở vào lồng 30 cm x 30 cm x 30 cm (tỷ lệ đực/cái = 1:1) cho hút nước đường glucose 10%. Sau 3 ngày tuổi, cho muỗi đốt chuột bạch. Ba ngày sau lần đốt máu vật chủ đầu tiên, đặt dụng cụ thu trứng vào lồng nuôi muỗi. Hàng ngày thu trứng, thay nước đường, cho muỗi đốt chuột cho tới khi số muỗi trong lồng nuôi chết hết.
Hàng ngày đếm số lượng muỗi đực, cái còn sống cho đến khi số muỗi theo dõi chết hết.
Thời gian sống của muỗi được tính theo cơng thức của Lanciani (1987) [58]
Sx eo x So o 2
eo: Thời gian sống x: Số ngày sau nở
So: Tổng số muỗi theo dõi
Sx: Số lượng muỗi sống ở ngày theo dõi
n: Số ngày từ khi muỗi bắt đầu nở cho tới ngày cuối cùng
Xác định thời gian sống của muỗi Ae. albopictus: Thực hiện các bước tương tự như muỗi Ae. aegypti.
* Xác định hoạt động đốt mồi của muỗi Ae. aegypti. Theo phương pháp bắt muỗi bằng bẫy màn mồi người.
- Xác định hoạt động hút máu của muỗi Ae. aegypti:
+ Thả 200 muỗi cái Ae. aegypti vào phòng 5 m x 4 m.
+ Trong phịng treo 2 màn: 01 màn đơi kích thước 2 m x 3 m x 3 m ở ngồi, bên trong màn đơi treo 01 màn đơn kích thước 1,2 m x 2 m x 2 m.
+ 01 người mồi muỗi ngồi phía bên trong màn đơn.
+ Khi treo màn đôi để mép dưới (chân màn) cách mặt sàn khoảng 15 – 20cm để muỗi có thể bay vào trong qua khoảng hở này.
+Tiến hành bắt muỗi đậu trên màn (màn đôi và màn đơn treo trong màn đôi). Mỗi giờ bắt một lần. Sử dụng đèn pin soi tìm muỗi và dùng ống tupe để bắt muỗi.
Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng theo nhiệt độ phòng được cập nhật khi tiến hành bắt muỗi.
Thời gian thực hiện từ 6 giờ sáng hôm trước đến 6 giờ sáng hơm sau. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
* Xác định hoạt động đốt mồi của muỗi Ae. albopictus: Thực hiện các bước tương tự như với muỗi Ae. aegypti.
n
2.1.4. Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số
- Tập huấn cho điều tra viên trước khi thực hiện. - Tuân thủ đúng qui định trong nghiên cứu. 2.1.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
- Số liệu thu thập được làm sạch trước khi nhập số liệu. Nhập số liệu được tiến hành bằng 2 máy tính độc lập để so sánh, tránh các sai số trong quá trình nhập. Nhập bằng phần mềm Microsoft Excel và chuyển tồn bộ số liệu sang định dạng của SPSS.
- Trong quá trình phân tích, các giá trị ngoại lai (các lồi muỗi khác) cũng được phát hiện và loại bỏ nhằm đảm bảo sự tập trung của số liệu.
2.2. Mục tiêu 2: Xác định độ nhạy cảm với hóa chất diệt cơn trùng của muỗi
Aedes aegypti và Aedes albopictus tại các điểm nghiên cứu bằng phương pháp
của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và của Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật Hoa Kỳ (USCDC).
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Muỗi, bọ gậy Ae. aegypti và Ae. albopictus tại điểm nghiên cứu. - Các hố chất diệt cơn trùng của WHO cung cấp Alphacypermethrin 30mg/m2, lambdacyhalothrin 0,05%, deltamethrin 0,05%, permethrin 0,75%.
- Các hố chất diệt cơn trùng của USCDC cung cấp: Alphacypermethrin, lambdacyhalothrin, deltamethrin, permethrin (bảng 1).
Bảng 2.1. Liều thử nghiệm và thời gian thử nghiệm của từng loại hóa chất đối với muỗi Aedes theo phương pháp USCDC (2019)
Hóa chất thử nghiệm
Liều hóa chất thử nghiệm /lồi
(µg/chai) Thời gian thử
Nghiệm (phút)
Ae. aegypti Ae. albopictus
Deltamethrin 12,5 10 30
Lambdacyhalothrin 12,5 10 30
Alphacypermethrin 12,5 10 30
Permethrin 21,5 15 30
2.2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm:
Tại thực địa: Chọn những điểm có dịch SXHD từ năm 2016 – 2019 hoặc nơi hiện có nhiều ca bệnh SXHD và/hoặc mật độ véc tơ cao (> 0,5 con/nhà) và/hoặc chỉ số Breteau cao (>20). Chú ý đặc biệt những khu vực đông dân cư như khu vực bệnh viện, trường học, khu công nghiệp.
Tại Hà Nội:
Quận Hai Bà Trưng: Phường Bạch Mai và phường Vĩnh Tuy Quận Hà Đông: Phường Kiến Hưng và xã Phú Lương Huyện Hoài Đức: Xã Sơn Đồng và xã La Phù
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu
a) Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu phịng thí nghiệm. - Nghiên cứu cắt ngang và mô tả.
b) Cỡ mẫu nghiên cứu
- Chọn ngẫu nhiên 50 nhà mỗi xã, phường để điều tra muỗi, bọ gậy Aedes. - Tất cả mẫu muỗi, quăng, bọ gậy Aedes thu thập được tại thực địa.
- Những mẫu muỗi còn sống sau khi tiếp xúc với hố chất diệt cơn trùng.
c) Phương pháp chọn mẫu
- Tại thực địa:
+ Đối với muỗi, bọ gậy Aedes thu thập ở thực địa: Tất cả muỗi, bọ gậy thu được từ các hộ gia đình.
+ Quy trình điều tra: Theo quy định của Bộ Y tế “QĐ Số 3711/QĐ-BYT ngày 19 tháng 9 năm 2014 của Bộ Y tế về việc ban hành Hướng dẫn giám sát và phòng, chống bệnh sốt xuất huyết Dengue” [59].
+ Muỗi Aedes sử dụng để xác định độ nhạy cảm theo phương pháp WHO (2016) và USCDC (2019): Muỗi trưởng thành chưa hút máu 2 - 5 ngày tuổi được nuôi từ bọ gậy/quăng bắt ở thực địa. Những mẫu muỗi cịn sống sau khi tiếp xúc với hố chất diệt côn trùng sẽ được sử dụng để phân tích tìm gen kháng.
d) Nội dung nghiên cứu
Điều tra thu thập muỗi Aedes tại các điểm nghiên cứu. Đánh giá các chỉ số muỗi trưởng thành và bọ gậy gồm 05 chỉ số: Chỉ số mật độ muỗi, chỉ số nhà có muỗi, chỉ số nhà có bọ gậy, chỉ số dụng cụ chứa nước có bọ gậy, chỉ số BI. Tập tính trú đậu (trong nhà, ngồi nhà, bề mặt giá thể, vị trí đặt giá thể). Xác định ổ bọ gậy Aedes (trong nhà, ngồi nhà, chất liệu, hình dáng, kích thước ổ đẻ).
- Tại phịng thí nghiệm: Xác định độ nhạy cảm của muỗi Aedes tại các điểm nghiên cứu với hố chất diệt cơn trùng bằng phương pháp WHO (2016) và USCDC (2019).
e) Phương pháp xác định biến số và đo lường biến số
- Thành phần các loài muỗi Aedes tại điểm nghiên cứu. - Mật độ các loài muỗi Aedes.
- Ổ bọ gậy nguồn của muỗi Aedes.
- Tỷ lệ muỗi chết sau 24 giờ thử nghiệm theo phương WHO. - Tỷ lệ muỗi chết sau 30 phút thử nghiệm theo phương USCDC.
f) Phiếu thu thập số liệu
- Phiếu điều tra muỗi Aedes,
- Phiếu phỏng vấn người tham gia nghiên cứu. - Phiếu ghi thông tin
g) Các chỉ số đánh giá
- Chỉ số nhà có quăng/bọ gậy (HI)(%) = (Số nhà điều tra có bọ gậy Aedes/ Tổng số nhà điều tra) x 100.
- Chỉ số dụng cụ chứa nước có bọ gậy/quăng (CI)(%) = (Số dụng cụ điều tra có bọ gậy Aedes/ Tổng số dụng cụ điều tra trong và ngoài nhà) x100. - Chỉ số Breteau (BI) = Số DCCN có bọ gậy Aedes trong 100 nhà điều tra. - Chỉ số mật độ muỗi (CSMĐM, DI)
- DI (con/nhà) = (Tổng số muỗi cái Aedes bắt được/ Tổng số nhà điều tra) - Chỉ số nhà có muỗi (CSNCM) (%) = (Tổng số nhà có muỗi cái Aedes/ Tổng
số nhà điều tra) x 100.
- Độ nhạy cảm của muỗi Aedes với HCDCT.
h) Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
Thu thập muỗi và bọ gậy Aedes theo quy trình giám sát véc tơ của Bộ Y tế năm 2014 [59]. Tại các điểm nghiên cứu, chọn ngẫu nhiên các hộ gia đình để điều tra muỗi và bọ gậy. Tiến hành điều tra từ 7 giờ sáng đến 11 giờ 30 phút và từ 13 giờ 30 phút đến 17 giờ, số hộ gia đình điều tra tối thiểu tại mỗi xã/phường từ 50 nhà trở lên. Mỗi xã/phường được tổ chức 2 nhóm điều tra, mỗi nhóm 3 người gồm: 01 người bắt muỗi, 01 người bắt bọ gậy và 01 người ghi chép số liệu. Tại mỗi hộ gia đình, bắt muỗi ở tồn bộ khơng gian trong và ngồi nhà nhưng khơng q 15 phút. Không gian trong nhà là các không gian được giới hạn bởi tường hoặc vách và có mái che. Khơng gian ngồi nhà là các khơng gian khơng có mái che như lối đi, sân… nằm giữa nhà ở chính với bếp, nhà tắm, nhà kho… hoặc là các khơng gian quanh nhà ở có mái che nhưng khơng có tường bao như hiên nhà, ban cơng…
+ Thu thập muỗi ngoài nhà: Dùng máy hút muỗi cầm tay, bắt muỗi đậu nghỉ ở những nơi muỗi hay trú đậu như lá cây, thân cây, thành các dụng cụ chứa nước, đồ vật vương vãi ngoài trời.
+ Thu thập muỗi trong nhà: Soi bắt muỗi đậu nghỉ ở những nơi muỗi hay trú đậu như gầm bàn, gầm giường, nơi treo quần áo…Muỗi được lưu giữ trong các tupe thủy tinh và ghi nhãn: địa điểm, vị trí, thời gian, người bắt muỗi.
+ Bắt bọ gậy trong các DCCN. Bọ gậy thu được ở mỗi DCCN được lưu giữ trong các lọ đựng mẫu có ghi nhãn: địa điểm, loại DCCN, số lượng bọ gậy, thời gian và người bắt. Bọ gậy sau khi thu thập được bảo quản và được vận chuyển về phịng thí nghiệm Khoa Côn trùng, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương. - Kỹ thuật định loại muỗi, bọ gậy Aedes: Theo khóa định loại muỗi, bọ gậy Aedes ở
Việt Nam [56] [57].
* Xác định độ nhạy cảm của muỗi Aedes với hóa chất diệt cơn trùng
- Kỹ thuật thử nhạy cảm theo phương pháp của WHO (2016)
[60]. Bước 1. Chuẩn bị ống nghỉ
Lấy một tờ giấy trắng sạch có kích thước 12 x 15 cm, ghi lên tờ giấy các thông tin cần thiết (số thứ tự ống, tên hóa chất, lồi muỗi và ngày tháng thử nghiệm), dùng kẹp bằng thép để giữ cho tờ giấy ép sát vào thành ống.
Bước 2. Cho muỗi vào ống nghỉ
Cho 25 con muỗi vào một ống nghỉ
Sau khi đã cho đủ 25 con muỗi vào ống, để ống nghỉ ở tư thế thẳng đứng với đầu ống có lưới hướng lên trên trong thời gian 1 giờ
Bước 4. Chuẩn bị ống tiếp xúc
Cho vào mỗi ống tiếp xúc một tờ giấy tẩm hố chất cần thử: cuộn tờ giấy tẩm thành hình trụ và lồng vào ống tiếp xúc. Dùng kẹp bằng đồng để giữ cho tờ giấy ép sát vào thành ống.
Bước 5. Chuyển muỗi từ ống nghỉ sang ống tiếp xúc
Lắp ống tiếp xúc vào tấm đế của ống nghỉ (trong ống nghỉ đã có muỗi) thổi hết sức nhẹ nhàng vào ống nghỉ để muỗi bay từ ống nghỉ sang ống tiếp xúc.
Bước 6. Muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hoá chất
Để ống tiếp xúc (có muỗi ở trong) ở vị trí thẳng đứng với đầu ống có lưới