Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.4.4. Phương pháp xác định số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và hàm
lượng Hb
Các phương pháp này đều thực hiện theo hướng dẫn trong Giáo trình thực hành Sinh lí học người và động vật, trong đó số lượng tiểu cầu được xác định theo phương pháp Fonio [34].
*Phương pháp xác định số lượng hồng cầu và bạch cầu (Hình 2.6)
Hình 2.6. Hình minh họa thao tác xác định số lượng hồng cầu và bạch cầu
- Bước 1: Chuẩn bị buồng đếm
Làm vệ sinh buồng đếm lamella và ống trộn hồng cầu, thông ống trộn hồng cầu bằng ether và để khô (hoặc tráng ống trộn hồng cầu bằng dung dịch chống đông). Đậy lamella trên lưới đếm của buồng đếm và đua lên kính hiển vi kiểm tra ở vật kính X10.
- Bước 2: Lấy mẫu máu và pha loãng máu
Dùng cồn sát trùng vị trí lấy máu, chờ cho khơ. Dùng kim trích máu vơ trùng để lấy máu. Lấy bơng gịn lau sạch giọt máu đầu tiên, dùng tay nặn và chờ cho máu tiếp tục chảy ra để lấy máu.
Dùng ống trộn hồng cầu/bạch cầu hút máu đến vạch 0,5. Nếu máu lên quá vạch thì dùng bơng gịn thấm nhẹ ở đầu ống. Thao tác phải dứt khoát, tránh bọt khí vào ống trộn.
Tiếp tục hút thêm dung dịch hồng cầu vào ống trộn hồng cầu đến vạch 101 (với ống trộn bạch cầu là vạch 11). Như vậy, máu đã được pha loãng 200 lần (với máu trong ống trộn bạch cầu là được pha loãng 20 lần). Nếu muốn pha loãng máu 100 lần, ta hút máu đến vạch số 1, rồi tiếp tục hút hung dịch pha lỗng đến vạch 101.
Dùng ngón tay cái và ngón giữa bịt hai đầu ống trộn và lắc đều để trộn máu với dung dịch pha loãng.
- Bước 3: Dàn máu vào buồng đếm
Bỏ vài giọt đầu trong ống trộn, đặt đầu ống trộn vào cạnh của lamelle tiếp giáp vứi buồng đếm, nhờ lực mao dẫn, máu pha loãng sẽ tràn đều vào buồng đếm (tránh để máu tràn vào quá nhiều, kết quả khơng chính xác). Đưa buồng đếm lên kính hiển vi và tiếng hành đếm số lượng hồng cầu/bạch cầu.
- Bước 4: Cách đếm
Chỉnh buồng đếm hiện rõ ở thị trường, chuyển qua vật kính X40, đếm số lượng hồng cầu thuộc 5 ơ trung bình (80 ơ nhỏ) bao gồm đếm 4 ơ ở 4 góc lưới đếm và 1 ơ ở giữa vị trí trung tâm. Việc xác định hồng cầu thuộc một ô được tuân theo nguyên tắc Egorov như trên (với số lượng bạch cầu đếm 25 ơ trung bình (400 ơ nhỏ) ở giữa trung tâm, ta được B bạch cầu).
- Bước 5: Cách tính số lượng tế bào hồng cầu/bạch cầu trong 1 mm3 máu
*Gọi số hồng cầu đếm được trong 80 ô vng nhỏ là A, diện tích 1 ơ vng nhỏ là 1/4000 mm3, máu pha lỗng 200 lần. Do đó, số lượng tế bào hồng cầu trong 1 mm3
máu (N) là:
𝑁 = 𝐴 𝑥 4000 𝑥 200
80 = 𝐴 𝑥 10000
*Nếu đếm trong 25 ơ trung bình (400 ơ nhỏ), ta có số lượng bạch cầu trong 1 mm3 (M) là:
𝑀 = 𝐵 𝑥 4000 𝑥 20
*Phương pháp xác định số lượng tiểu cầu – Phương pháp Fonio
Nguyên tắc: Trên tiêu bản máu nhuộm, đếm số lượng tiểu cầu có trong 1000 hồng cầu, căn cứ vào số lượng hồng cầu có trong 1 mm3 máu để tính ra số lượng tiểu cầu trong 1 mm3 máu.
*Phương pháp xác định hàm lượng hemoglobin
Cho dung dịch HCl 0,1N vào huyết sắc kế Sahli tới vạch thấp nhất. Dùng kim trích máu lấy máu ở tĩnh mạch đuôi chuột, hút máu vào pipette Sahli đến vạch 0,02 mL. Sau đó cho ngay vào đáy huyết sắc kế Sahli có sẵn chứa HCl 0,1N. Thổi nhẹ cho máu vào ống cho lắng xuống đáy, hút HCl lên ống để rửa hết máu trong pipette. Dùng đũa thủy tinh khuấy đều, để yên trong 5 phút. HCl tác dụng với máu thành dung dịch hematin chlohydrate có màu nâu sẫm. Đặt ống vào giá, dùng pipette nhỏ từng giọt nước cất vào khuấy đều bằng đũa thủy tinh. Tiếp tục nhỏ từng giọt nước cất vào cho đến khi quan sát thấy 3 ống trên giá có màu như nhau thì dừng lại (Hình 2.7), quan sát chỉ số nào theo bảng chia độ thứ 1 tương ứng với mực dung dịch trong ống và ghi nhận kết quả. Đây là nồng độ Hb trong máu với đơn vị g% (trong 100 g dung dịch chứa số g Hb).
Hình 2.7. Hình minh hoạ thao tác xác định hàm lượng Hb