2.3.4.4. Phương pháp xác định số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và hàm lượng Hb lượng Hb
Các phương pháp này đều thực hiện theo hướng dẫn trong Giáo trình thực hành Sinh lí học người và động vật, trong đó số lượng tiểu cầu được xác định theo phương pháp Fonio [34].
*Phương pháp xác định số lượng hồng cầu và bạch cầu (Hình 2.6)
Hình 2.6. Hình minh họa thao tác xác định số lượng hồng cầu và bạch cầu
- Bước 1: Chuẩn bị buồng đếm
Làm vệ sinh buồng đếm lamella và ống trộn hồng cầu, thông ống trộn hồng cầu bằng ether và để khô (hoặc tráng ống trộn hồng cầu bằng dung dịch chống đông). Đậy lamella trên lưới đếm của buồng đếm và đua lên kính hiển vi kiểm tra ở vật kính X10.
- Bước 2: Lấy mẫu máu và pha lỗng máu
Dùng cồn sát trùng vị trí lấy máu, chờ cho khơ. Dùng kim trích máu vơ trùng để lấy máu. Lấy bơng gịn lau sạch giọt máu đầu tiên, dùng tay nặn và chờ cho máu tiếp tục chảy ra để lấy máu.
Dùng ống trộn hồng cầu/bạch cầu hút máu đến vạch 0,5. Nếu máu lên quá vạch thì dùng bơng gịn thấm nhẹ ở đầu ống. Thao tác phải dứt khốt, tránh bọt khí vào ống trộn.
Tiếp tục hút thêm dung dịch hồng cầu vào ống trộn hồng cầu đến vạch 101 (với ống trộn bạch cầu là vạch 11). Như vậy, máu đã được pha loãng 200 lần (với máu trong ống trộn bạch cầu là được pha loãng 20 lần). Nếu muốn pha loãng máu 100 lần, ta hút máu đến vạch số 1, rồi tiếp tục hút hung dịch pha loãng đến vạch 101.
Dùng ngón tay cái và ngón giữa bịt hai đầu ống trộn và lắc đều để trộn máu với dung dịch pha loãng.
- Bước 3: Dàn máu vào buồng đếm
Bỏ vài giọt đầu trong ống trộn, đặt đầu ống trộn vào cạnh của lamelle tiếp giáp vứi buồng đếm, nhờ lực mao dẫn, máu pha loãng sẽ tràn đều vào buồng đếm (tránh để máu tràn vào quá nhiều, kết quả khơng chính xác). Đưa buồng đếm lên kính hiển vi và tiếng hành đếm số lượng hồng cầu/bạch cầu.
- Bước 4: Cách đếm
Chỉnh buồng đếm hiện rõ ở thị trường, chuyển qua vật kính X40, đếm số lượng hồng cầu thuộc 5 ơ trung bình (80 ơ nhỏ) bao gồm đếm 4 ô ở 4 góc lưới đếm và 1 ơ ở giữa vị trí trung tâm. Việc xác định hồng cầu thuộc một ô được tuân theo nguyên tắc Egorov như trên (với số lượng bạch cầu đếm 25 ơ trung bình (400 ơ nhỏ) ở giữa trung tâm, ta được B bạch cầu).
- Bước 5: Cách tính số lượng tế bào hồng cầu/bạch cầu trong 1 mm3 máu
*Gọi số hồng cầu đếm được trong 80 ô vng nhỏ là A, diện tích 1 ơ vng nhỏ là 1/4000 mm3, máu pha lỗng 200 lần. Do đó, số lượng tế bào hồng cầu trong 1 mm3
máu (N) là:
𝑁 = 𝐴 𝑥 4000 𝑥 200
80 = 𝐴 𝑥 10000
*Nếu đếm trong 25 ơ trung bình (400 ơ nhỏ), ta có số lượng bạch cầu trong 1 mm3 (M) là:
𝑀 = 𝐵 𝑥 4000 𝑥 20
*Phương pháp xác định số lượng tiểu cầu – Phương pháp Fonio
Nguyên tắc: Trên tiêu bản máu nhuộm, đếm số lượng tiểu cầu có trong 1000 hồng cầu, căn cứ vào số lượng hồng cầu có trong 1 mm3 máu để tính ra số lượng tiểu cầu trong 1 mm3 máu.
*Phương pháp xác định hàm lượng hemoglobin
Cho dung dịch HCl 0,1N vào huyết sắc kế Sahli tới vạch thấp nhất. Dùng kim trích máu lấy máu ở tĩnh mạch đuôi chuột, hút máu vào pipette Sahli đến vạch 0,02 mL. Sau đó cho ngay vào đáy huyết sắc kế Sahli có sẵn chứa HCl 0,1N. Thổi nhẹ cho máu vào ống cho lắng xuống đáy, hút HCl lên ống để rửa hết máu trong pipette. Dùng đũa thủy tinh khuấy đều, để yên trong 5 phút. HCl tác dụng với máu thành dung dịch hematin chlohydrate có màu nâu sẫm. Đặt ống vào giá, dùng pipette nhỏ từng giọt nước cất vào khuấy đều bằng đũa thủy tinh. Tiếp tục nhỏ từng giọt nước cất vào cho đến khi quan sát thấy 3 ống trên giá có màu như nhau thì dừng lại (Hình 2.7), quan sát chỉ số nào theo bảng chia độ thứ 1 tương ứng với mực dung dịch trong ống và ghi nhận kết quả. Đây là nồng độ Hb trong máu với đơn vị g% (trong 100 g dung dịch chứa số g Hb).
Hình 2.7. Hình minh hoạ thao tác xác định hàm lượng Hb
2.3.4.5. Phương pháp xác định thời gian đông máu
Xác định bằng phương pháp Milian: Dùng 2 lame kính sạch và khơ, lấy mẫu máu từ tĩnh mạch chuột nhỏ vào mỗi lame kính 1 giọt (đường kính 1 cm), bấm đồng hồ ngay khi chảy máu. Đặt 2 lame kính vào đĩa petri và đậy lại. Sau 2 phút, nhấc lame 1 rồi nghiêng một góc 45o xem giọt máu đã đông chưa, cứ 30 giây kiểm tra cho đến
khi nghiêng lame kính giọt máu khơng thay đổi hình dạng là máu đã đơng. Lame thứ 2 cũng quan sát như vậy cho tới khi máu đơng. Bấm đồng hồ dừng lại (Hình 2.8). Thời gian đơng máu tính cho đến khi máu đơng ở phiến kính thứ 2.
Hình 2.8. Hình minh hoạ thao tác xác định tốc độ đông máu
2.3.4.6. Phương pháp xác định Hematocrit
Cho một lượng máu vào ống mao dẫn hematocrit và li tâm ở tốc độ (3200 vòng/phút) trong 15 phút. Lấy kết quả và đọc chỉ số hemacrotit trên một thước đo (Hình 2.9).
2.3.4.7. Phương pháp làm tiêu bản máu
Các bước làm tiêu bản máu được thực hiện theo hướng dẫn trong giáo trình thực hành Sinh lí học người và động vật [34], cụ thể (Hình 2.10):
Hình 2.10. Hình minh hoạ thao tác làm tiêu bản máu
Bước 1: Chuẩn bị mẫu máu: dùng cồn sát trùng vị trí lấy máu, chờ cho khơ. Nhỏ giọt dung dịch MgSO4 14% lên vị trí lấy máu vừa sát trùng. Dùng kim trích máu vơ trùng chích qua giọt MgSO4 để máu chảy tự nhiên hoà với dung dịch. Lấy máu này làm tiêu bản và nhuộm Giemsa.
Bước 2: Dàn mỏng mẫu máu: lấy mẫu máu đã chuẩn bị ở bước 1 bỏ vài giọt đầu, chấm nhẹ 1 giọt máu lên cuối lame thứ nhất. Lấy lame 2 chạm vào giọt máu với góc nghiêng 30 - 45o, để giọt máu lan theo cạnh lame rồi kéo lame 2 từ đầu này sang đầu kia với tốc độ vừa phải nhưng vẫn giữ nguyên với góc nghiêng như vậy, lúc này ta đã dàn đều giọt máu thành lớp mỏng trên lame. Để tiêu bản máu khô tự nhiên hoặc có thể dùng gió, tủ ấm, hơ nhẹ trên đèn cồn làm khô tiêu bản.
Bước 3: Cố định tiêu bản: Sử dụng cồn methylic nhỏ đều trên tiêu bản máu, sau đó để đứng tiêu bản trên giá cho alcohol chảy hết và để tiêu bản khô tự nhiên.
Bước 4: Nhuộm tiêu bản: Tuỳ vào phương pháp sử dụng thuốc nhuộm, người ta có thể tiến hành nhuộm đơn hoặc nhuộm kép. Tiêu bản máu đã được cố định bằng alcohol được ngâm trong dung dịch Giemsa (2 mL Giemsa pha với 18 mL nước cất, lắc đều) trong 15 - 20 phút (có thể nhỏ dung dịch Giemsa phủ đều trên mẫu máu của tiêu bản đã cố định khi không dùng cốc ngâm lame). Gác các lame mẫu lên các thanh thủy tinh nằm ngang trên miệng một chậu thủy tinh, tránh hoá chất chạm vào tay và quần áo người làm. Rửa tiêu bản bằng nước cất một góc nghiêng (khơng để nước
chảy vào chỗ có tiêu bản máu) đến khi nước trong, khơng cịn phai màu. Để khơ mẫu tự nhiên (hoặc sấy khô nhẹ trong tủ ấm hay trên ngọn đèn cồn).
2.3.4.8. Phương pháp xác định kích thước hồng cầu
Quan sát mẫu tiêu bản máu dưới kính hiển vi. Sử dụng phần mềm S – Eye đo bán kính của các hồng cầu (Hình 2.11). Mỗi nghiệm thức lấy ngẫu nhiên các lame và tiến hành đo bán kính của 300 hồng cầu, xuất số liệu dạng file excel, thống kê và ghi nhận kết quả.
Hình 2.11. Hình minh hoạ đo kích thước hồng cầu bằng phần mền S – Eye
2.3.4.9. Phương pháp thu máu tồn phần
Trước khi lấy máu, cho chuột nhịn đói 1 đêm hôm trước, sáng hôm sau tiến hành lấy máu. Lấy máu 1 lần vào cuối đợt thí nghiệm, chuột được gây mê bằng cách tiêm thuốc mê (ketamine và xylazine) liều 0,02 ml/10 g thể trọng, chờ 2 phút cho chuột đi vào trạng thái mê, tiến hành lấy máu ở tĩnh mạch hốc mắt chuột bằng ống hematocrit và cho máu vào ống falcon loại 15 ml, dùng mẫu máu này để thu huyết thanh đánh giá một số chỉ số sinh hoá và tiết niệu.
2.3.4.10. Phương pháp chuẩn bị - khảo sát mẫu huyết thanh
Lấy mẫu máu thu được ở từng chuột đem li tâm ở tốc độ 3200 vòng/phút trong 15 phút, lúc này huyết thanh sẽ trong ở phía trên, cịn tế bào máu sẽ lắng xuống dưới.
Thu lượng huyết thanh vào ống eppendorf. Sau đó, mẫu được chuyển đến Bệnh viện Hòa Hảo, khoa xét nghiệm (Medic – Lab), 254 Hịa Hảo, Phường 4, Quận 10 Thành phố Hồ Chí Minh để xét nghiệm. Kết quả được trả cùng ngày.
2.3.4.11. Phương pháp khảo sát cấu trúc mô học cơ quan của chuột
- Kết thúc đợt thí nghiệm, thực hiện giải phẫu chuột bằng cách kéo giãn đốt sống cổ, mổ khoang bụng để lộ gan, thận và lách.
- Quan sát hình thái đại thể các cơ quan: gan, thận, lách và đánh giá cảm quan với những đặc điểm bất thường.
- Thu nhận mẫu gan, thận, lách và cố định trong dung dịch formaldehyde 10% bổ sung KH2PO4 (4 g/1000 ml) và Na2HPO4 (6,5 g/1000 ml), có ghi đầy đủ thơng tin từng mẫu (Hình 2.12). Sau đó, mẫu được chuyển đến phòng Giải phẫu bệnh của Phòng khám đa khoa Đại Phước, 831 Đường 3/2, Phường 7, Quận 11, Thành phố Hồ Chí Minh để nhuộm H&E (mỗi nghiệm thức chọn ngẫu nhiên 6 mẫu để nhuộm). Sau khi có tiêu bản cố định, mức độ tổn thương từng mẫu được đánh giá qua hình ảnh dưới kính hiển vi đảo ngược.
Hình 2.12. Hình minh hoạ mẫu gan, thận, lách cố định trong formaldehyde 10%
2.3.4.12 Phương pháp xử lí số liệu
Tất cả số liệu của đề tài được xử lí theo các thuật tốn xác suất thống kê trên máy vi tính bằng phần mềm Minitab 18. Phân tích phương sai một yếu tố (One – way
Anova). Các số liệu trung bình được trình bày ở dạng ± 95% CI. Mức ý nghĩa được sử dụng để kiểm định sai khác có ý nghĩa các nghiệm thức là 0,05 (p < 0,05 thì sự sai khác có ý nghĩa thống kê). Phân tích phương sai hai yếu tố (Two – way Anova) về thời gian và nghiệm thức thí nghiệm. Dùng hàm Turkey để kiểm định các số liệu.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC NỒNG ĐỘ KẼM LÊN ĐỘ TĂNG TRỌNG CỦA CHUỘT CỦA CHUỘT
Tổng cộng có 48 chuột được kiểm tra cân nặng trước khi đưa vào bố trí thí nghiệm để đảm bảo sự tương đồng về trọng lượng. Kết quả cân nặng trung bình của chuột đưa vào thí nghiệm đạt 21,25 ± 0,35 g (xem phụ lục 1.2). Kết quả bố trí chuột ngẫu nhiên vào các nghiệm thức có sự đồng đều về khối lượng cơ thể (p = 0,883), (xem phụ lục 1.2). Như vậy, điều kiện ban đầu thí nghiệm của các chuột tương đương nhau về khối lượng cơ thể, điều này giúp cho sự đánh giá các kết quả thí nghiệm có độ tin cậy cao hơn.
3.1.1. Độ tăng trọng trung bình của chuột tại các nghiệm thức khảo sát sau mỗi 2 tuần nuôi
Từ phụ lục 1.3, ta có độ tăng trọng trung bình của các nghiệm thức khảo sát qua mỗi 2 tuần thí nghiệm. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.1.
Hình 3.1. Đồ thị thể hiện độ tăng trọng của chuột tại các nghiệm thức khảo sát sau mỗi 2 tuần nuôi
Sau 2 tuần thí nghiệm, chuột ở tất cả các nghiệm thức (ĐC, Zn50, Zn70 và Zn90) dao động khơng nhiều và chưa có sự chênh lệch đáng kể, mang sự tương đồng về mặt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Sau 4 tuần thí nghiệm, ở cả ba nghiệm thức có kẽm, độ tăng trọng giảm, tương đương với nhau về mặt ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Trong đó, hai nghiệm thức Zn70 và Zn90 có sự khác biệt với độ tăng trọng ở nghiệm thức ĐC và sự khác biệt này mang ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Bên cạnh đó, độ tăng trọng giữa nghiệm thức ĐC và Zn50 đã xuất hiện sự khác biệt nhưng vẫn chưa rõ ràng về mặt ý nghĩa thống kê (11,72 so với 10,92 g, p > 0,05, tương ứng).
Sau 6 tuần thí nghiệm, chuột ở nghiệm thức ĐC có độ tăng trọng vẫn duy trì ở mức cao hơn so với các nghiệm thức Zn70 và Zn90 (p < 0,05); Trong khi đó, các nghiệm thức có kẽm vẫn duy trì độ tăng trọng tương đương nhau (p > 0,05), nhưng chuột ở nghiệm thức Zn50 tuy có độ tăng trọng giảm nhưng vẫn chưa có sự khác biệt rõ ràng về mặt ý nghĩa thống kê với nghiệm thức ĐC (12,03 so với 14,02 g; p > 0,05, tương ứng).
Sau 8 tuần thí nghiệm, chuột ở nghiệm thức ĐC vẫn có tốc độ tăng trọng vẫn duy trì ở mức cao hơn so với các nghiệm thức Zn70 và Zn90 (p < 0,05). Các nghiệm thức có kẽm vẫn duy trì tốc độ tăng trọng tương đương nhau (p > 0,05). Bên cạnh đó, chuột ở nghiệm thức Zn50 có độ tăng trọng vẫn thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng nhưng vẫn chưa xuất hiện sự khác biệt rõ ràng về mặt ý nghĩa thống kê (13,37 so với 15,06 g; p > 0,05, tương ứng).
Kết quả cho thấy, bắt đầu sau 4 tuần thí nghiệm, kẽm đã tác động làm chậm tốc độ tăng trọng rõ rệt ở hai nồng độ 70 mg/kg thể trọng và 90 mg/kg thể trọng, trong khi đó, kẽm ở nồng độ 50 mg/kg thể trọng mới bước đầu xuất hiện dấu hiệu tác động làm chậm tốc độ tăng trọng ở chuột. Sau 6 và 8 tuần, kẽm ở hai nồng độ 70 mg/kg thể trọng và 90 mg/kg thể trọng vẫn tiếp tục làm giảm tốc độ tăng trọng ở chuột, tuy kẽm ở nồng độ 50 mg/kg thể trọng cũng đã tác động làm giảm tốc độ tăng trọng nhưng vẫn chưa đủ cho thấy sự khác biệt so với chuột ở điều kiện thường.
3.1.2. Sự tương quan giữa hai yếu tố nghiệm thức và thời gian nuôi ảnh hưởng lên độ tăng trọng của chuột hưởng lên độ tăng trọng của chuột
Khi xét về sự tương quan giữa hai yếu tố nghiệm thức và thời gian nuôi ảnh hưởng lên độ tăng trọng của chuột (xem phụ lục1.3.2.c) cho thấy:Từng yếu tố đơn lẻ (thời gian hoặc nghiệm thức) đều có ảnh hưởng rõ rệt lên độ tăng trọng của chuột (p < 0,01) ở các nghiệm thức. Từ biểu đồ 3.1 cho thấy, tốc độ tăng trọng của chuột tuân theo quy luật chung, cân nặng của chuột tăng qua mỗi 2 tuần ni và càng về sau thì tốc độ tăng trọng chậm lại theo thời gian kể cả ở nghiệm thức đối chứng. Điều này có thể được giải thích là do chuột ngày càng đạt đến độ tuổi trưởng thành.
Tại thời điểm 4 tuần trở về sau, các nghiệm thức có kẽm đều có tốc độ tăng trọng chuột chậm hơn so với nghiệm thức đối chứng, điều này thể hiện rõ rệt nhất ở 2 nghiệm thức Zn70 và Zn90 (p < 0,05), riêng nghiệm thức Zn50 cũng có tốc độ tăng trọng chậm hơn nhưng chưa khác biệt với nghiệm thức đối chứng.
Như vậy, nhiễm độc kẽm ở hai nồng độ 70 và 90 mg/kg thể trọng đã thể hiện ảnh hưởng thông qua việc làm giảm độ tăng trọng ở chuột sau 2 tháng thí nghiệm trong khi kẽm ở nồng độ 50 mg/kg thể trọng vẫn chưa thể hiện rõ ràng sự tác động.
Bàn luận
Mức tăng trọng lượng cơ thể giảm 46% được thấy ở bê non tiêu thụ 91 mg kẽm/ kg/ngày dưới dạng oxit kẽm trong 5 tuần; khơng có tác dụng ở mức 64 mg kẽm/kg/ngày. Mức độ liên quan của hiệu ứng này đối với con người là không rõ ràng. Trọng lượng cơ thể của thỏ, chuột và chồn không bị ảnh hưởng bởi liều lượng tương ứng với 174, 191 và 326,7 mg kẽm/kg/ngày đối với 3 – 12 tháng. Giảm trọng lượng cơ thể sau sinh ở động vật F0 được quan sát thấy ở chuột tiếp xúc với 7 mg kẽm/kg/ngày dưới dạng kẽm clorua trong 20 tuần [14].
Nghiên cứu của [35], khi cho chuột đực và cái (4 – 6 tuần) bổ sung kẽm với hàm lượng cao (0,75 – 1%) trong 5 tuần. Kết quả cho thấy, nghiệm thức bổ sung kẽm (ZnCO3, ZnCl2 và ZnO) ở hàm lượng cao làm giảm độ tăng trọng của chuột đáng kể so với nghiệm thức đối chứng sau 5 tuần khảo sát. Kết quả cũng tương đồng với