2.1.1. Hoá chất .
- CuSO4 Trung Quốc. - Na2CO3 Trung Quốc. - H2SO4 Trung Quốc. - Phenol Trung Quốc. - Oxbile dride pure Merck, ðức. - Pepton Trung Quốc. - Cao nấm men Việt Nam. - Glucose Việt Nam. - KH2PO4 Trung Quốc. - K2HPO4 Trung Quốc. - MgSO4.7H2O Trung Quốc. - MnSO4.H2O Việt Nam.
- CaCO3 Trung Quốc.
- Agar Việt Nam.
- Ninhydrin Nhật - Giấy TLC ðức
Và một số hoá chất khác của ðức, Mỹ, Nhật Bản, Trung Quốc và Việt Nam
2.1.2. Dụng cụ:
Pipet các loại Trung Quốc, ðức Micropipet ðức
Các loại cốc 25,50,100....1000ml Trung Quốc, ðức Ống ñong các loại Trung Quốc, ðức Các dụng cụ cần thiết khác
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 36 2.1.3. Thiết bị
Nồi hấp thanh trùng : Sturdy SA-300VF, Sturdy industrial, Nhật. Máy ly tâm eppendoft : Mikro 22R, Hettich Zentrifugen, ðức. Tủ cấy vô trùng : Bassaire, Anh.
Máy ño pH : Martini intrusments, Mauritius, EU. Tủ sấy dụng cụ : Sanyo, Nhật Bản.
Tủ nuôi vi sinh vật : Sanyo, Nhật Bản. Một số thiết bị khác
2.1.4. Môi trường
2.1.4.1. Môi trường nuôi cấy
Môi trường MRS : Bảng 2: Thành phần môi trường MRS Thành phần Hàm lượng (%) Thành phần Hàm lượng (%)
Glucose 2 Sodium acetate 0.5
Polypepton 1 K2HP04.3H20 0.2
Cao thịt 1 Aminocitrate 0.2
Cao nấm men 0.5 CaC03 1.4
MgS04.7H20 0.06 Agar 1.4
Tween 80 0.1
pH : 6.5-6.8
- Môi trường MRS lỏng và MRS có bổ sung agar 20g/l và 0.3% CaCO3
- Môi trường sinh tổng hợp GABA: Sử dụng môi trường MRS lỏng bổ sung 1% MSG ( gọi là môi trường MRSS).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 37 2.1.4.2. Môi trường dịch dạ dày
Pepsin 10X
Pha 0,3g Pepsin trong 10ml nước vô trùng, sau ñó lọc qua màng lọc 0,2µm trong ñiều kiện vô trùng, bảo quản ở -200C. ðệm glycine HCl pH 2,0
Dung dịch ñệm glycine HCl ñược pha bằng 6,25ml glycine 0,2M hiệu chỉnh pH bằng HCl 0,2M. Sau ñó ñược ñịnh mức 25 ml bằng nước deion ñược dung dịch ñệm glycine HCl pH 2,0.
Môi trường dịch dạ dày
Môi trường dịch dạ dày pH 2,0 ñược pha bằng dịch ñệm glycine và pepsin 10X với tỉ lệ 9:1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.1.4.3. Môi trường dịch ruột Pancreatin 10X
Cân 0,1g pancreatin pha trong 10ml nước vô trùng, bảo quản ở -200C.
Dung dịch ñệm muối mật 0,3% +NaCl 0,5%
Cân 0,3g oxbile drive pure và 0,5g NaCl hòa tan trong 100ml. pH xác ñịnh ñược sau khi tạo thành dung dịch là 8,0. Dung dịch này ñược hấp vô trùng tại 1210C, trong 15 phút.
Dịch ruột
Dịch ruột ñược chuẩn bị bằng dung dịch ñệm muối mật và pancreatin 10X.với tỉ lệ 9:1. Dung dịch ñệm PBS Thành phần g/l KCl 0,2 Na2HPO4 1,44 NaCl 8 KH2PO4 0,24 pH 7,0
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 38 2.1.4.4. Môi trường kiểm tra khả năng sử dụng ñường
Thành phần g/l Pepton 20 Cao nấm men 10 Tween 80 2 K2HPO4.3H2O 5,24 CH3COONa 10 (NH4)3citrat 4 MgSO4.3H2O 0.4 MnSO4.H2O 0.1 Bromocresol purple 0.34 pH 6,8 Thanh trùng ở 1210C/15 phút
Bổ sung các loại ñường cần kiểm tra khả năng sử dụng với nồng ñộ 10g/l 2.2. Chủng vi sinh vật:
Ba tám chủng vi khuẩn lactic lấy từ bộ sưu tập giống của Trung tâmVi sinh Công nghiệp - Viện Công nghiệp thực phẩm ñể tuyển chọn chủng sinh tổng hợp GABA.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp GABA
Quá trình sinh tổng hợp GABA: ðể tổng hợp GABA từ vi khuẩn lactic sử dụng môi trường MRSS .
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 39 Các chủng sau khi tuyển chọn ñược lên men trong 10ml môi trường MRS lỏng không bổ sung CaCO3, nuôi ở 300C trong vòng từ 18-24 giờ. Sau 18-24 giờ dùng pipet hút 1% môi trường nuôi cấy từ các ống nghiệm lên men vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường MRS lỏng bổ sung 1% MSG. Sau ñó các ống nghiệm ñược nuôi ở 300C trong vòng 24 h giờ. Mẫu sau khi nuôi cấy ñem li tâm ở ñiều kiện 10.000 vòng/ 1phút trong 10 phút ở 4oC, thu hồi phần dịch trong ñể xác ñịnh GABA.
2.3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng probiotic
Khả khả năng sống của vi khuẩn lactic trong môi trường dịch dạ dày Giống ñược nuôi cấy trên môi trường MRS broth trong 24h tại nhiệt ñộ 300C. Kết thúc 24h, dịch lên men ñược ly tâm tại 10.000 vòng /1 phút trong 5 phút, tại nhiệt ñộ 240C ñể thu sinh khối tế bào. Sinh khối tế bào sau ly tâm ñược rửa 2 lần với ñệm PBS vô trùng. Sau ñó, tái huyền phù trong dịch dạ dày pH 2,0. Lấy mẫu trang cấy trên thạch ñĩa tại các thời ñiểm 0 phút và 120 phút ñể xác ñịnh số lượng tế bào sống. Khả năng sống của các chủng lactic trong dịch dạ dày ñược ñánh giá dựa trên số lượng khuẩn lạc ñếm ñược trên các ñĩa petri sau khi nuôi ở 300C.
Khả năng sống của vi khuẩn lactic trong môi trường dịch mật
Giống ñược nuôi cấy trên môi trường MRS broth trong 24h tại nhiệt ñộ 300C. Kết thúc 24h, dịch lên men ñược ly tâm tại 10.000 vòng/1 phút trong 5 phút, tại nhiệt 240C ñể thu sinh khối tế bào. Sinh khối tế bào sau ly tâm ñược rửa 2 lần với ñệm PBS vô trùng. Sau ñó, tái huyền phù trong môi trường dịch ruột nhân tạo. Lấy mẫu trang cấy trên thạch ñĩa tại các thời ñiểm 0 phút và 240 phút ñể xác ñịnh số lượng tế bào sống.
Khả năng kháng kháng sinh của khuẩn lactic
Kiểm tra khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lactic trên 12 loại kháng sinh khác nhau (ñối chứng âm là nước).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 40
Bảng 3: Các loại kháng sinh khác nhau
Tên kháng sinh Ký hiệu Dung môi hòa
tan
Nồng ñộ trên khoanh giấy
(µg)
Clindamycin CLI Nước 2
Chloramphenicol CHL Ethanol 30
Erythromycin ERY 95% ethanol 15
Cefoperzone CFP Nước 30 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ceftriaxone CTR Nước 30
Penicillin PEN Nước 10IU
Ceftazidime CAZ Nước 30
Polymycin B PB Nước 300IU
Gentamycin GEN Nước 10
Streptomycin STR Nước 10
Ofloxacin OFL Nước 5
Azithromycin AZI 95% ethanol 15
Tiến hành : Giống lactic ñảm bảo sạch ñược nuôi cấy trong môi trường
MRS broth tại 300C/24h. Dùng kẹp bông vô trùng cấy ria giống trên khắp mặt thạch MRS. ðặt các khoanh giấy lọc ñã sấy vô trùng có ñường kính 6mm lên bề mặt thạch. Từ từ nhỏ 5µl dịch kháng sinh có nồng ñộ kháng sinh như bảng trên thấm ñều lên khoanh giấy lọc. ðặt tại 40C ñể kháng sinh thẩm thấu vào ñĩa thạch. Sau ñó nuôi ở 300C/24h. ðo vòng vô khuẩn.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 41 Xác ñịnh khả năng kháng 1 số chủng vi sinh vật gây bệnh
Chuẩn bị vi sinh vật kiểm ñịnh:
Các chủng vi sinh vật gây bệnh ñược nuôi cấy trong (NB), nuôi cấy lắc tại 370 C trong vòng 24h. Nếu các chủng vi sinh vật gây bệnh này ñuợc lấy từ lạnh sâu hoặc ñông khô thì nên hoạt hóa 2 lần cho giống khỏe.
Sử dụng các chủng vi sinh vật gây bệnh sau:
Bảng 4: Một số chủng vi sinh vật gây bệnh
STT Tên khoa học Ký hiệu chủng
1 Bacillus cereus CNTP6089
2 Staphylococcus aureus CNTP6083
3 Pseudomonas aeruginosa CNTP6084
4 Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae NBRC3321
5 Listeria monotocygenes ATCC13932
Chuẩn bị dụng cụ:
Chuẩn bị môi trường cỏ: Môi truờng MRS broth agar 20ml/ ñĩa Chuẩn bị bông : Bông cuộn thành cuộn nhỏ, sấy vô trùng 140oC/4h
Chuẩn bị tăm: Tăm ñược ñể trong ñĩa pettri gói giấy báo và sấy vô trùng 140oC/4h.
Chuẩn bị kẹp: Kẹo ñược gói giấy báo và sấy vô trùng ở 140oC/4h.
Tiến hành thí nghiệm
Trang giống trên mặt thạch: Dùng kẹp vô trùng kẹp chặt bông lại và ñưa vào ống nghiệm chứa giống ñã hoạt hóa 24h. Sau ñó dùng kẹp di bông trên khắp mặt ñĩa pettri có môi trường MRS agar sao cho giống trải ñều khắp mặt thạch (có thể dùng bông thấm giống 2 lần trên 1 ñĩa ñể lượng giống trên ñĩa nhiều hơn.)