Th nghi m sinh hoá o S đ đnh danh m t s vi khu n đ ng ru t th ng g p: Hình 2.11. S đ đnh danh m t s vi khu n đ ng ru t th ng g p [21] KIA G(+), L(+), H2S(ậ) Escherichia coli Klebsiella Enterobacter Proteus agglomerans Citrate + ậ E. coli P.agglomeran Klebsiella Enterobacter Di đ ng + ậ Enterobacter Klebsiella Lysin + ậ E. coli P.agglomerans
o S đ đnh danh Klebsiella pneumoniae b ng m t s th nghi m sinh hóa
Hình 2.12. S đ đ nh danh K. pneumoniae b ng các th nghi m sinh hóa [15]
Th nghi m oxidase:
Nguyên t c: th nghi m này nh m xác đ nh s hi n di n c a h enzyme oxidase vi sinh v t. Thành viên quan tr ng nh t c a h th ng này là cytochrome oxidase trong chu i truy n đi n t c a hơ h p hi u khí v i O2 là ch t nh n đi n t sau cùng nên ch hi n di n trong các lồi vi sinh v t hi u khí hay k khí tu ý. S ch ng lo i cytochrome trong t bƠo thay đ i tu thu c vào t ng loài vi sinh v t.
Ho t tính cytochrome oxidase đ c phát hi n nh thu c th p ậ phenylenediamine.
Trong đi u ki n có s hi n di n c a cytochrome c kh trong t bào, thu c th này
b oxy hoá thành m t h p ch t indolphenol có mƠu xanh d ng. [7]
Th kh n ng lên men đ ng: th nghi m KIA K. oxytoca Gram (-), Oxidase (-) LDC E. cloacae K. pneumoniae Lactose (+) H2S Urease (+) Citrobacter freundii Indol Citrobacter koseri Indol Urease (ậ) E. coli E. aerogenes Indol + + + + + - - - - -
Nguyên t c: th nghi m này nh m xác đ nh kh n ng s d ng m t ngu n carbon nh t đnh b i vi sinh v t đ t ng tr ng. Th nghi m KIA dùng phân bi t nhóm sinh v t lên men glucose vƠ lactose đ ng th i bi t đ c kh n ng sinh h i vƠ
H2S c a vi khu n. Vi sinh v t lên men đ ng t o ra acid lƠm pH môi tr ng gi m, ch th màu s thay đ i đ ng th i sinh h i lƠm môi tr ng th ch b đ y lên ho c v
ra trong môi tr ng nuôi c y.
Klebsiella pneumoniae có kh n ng lên men c lactose và glucose làm pH
môi tr ng gi m. V i ch th mƠu phenol red lƠm môi tr ng chuy n sang vàng.
ng th i chúng có kh n ng sinh h i m nh nên làm v th ch ho c đ y môi tr ng lên cao.
Pseudomonas aeruginosa thu c nhóm tr c khu n không lên men đ ng nên
không lƠm thay đ i pH c a mơi tr ng, do đó khơng lƠm đ i màu ch t ch th .
Th nghi m kh n ng sinh H2S [7]
Nguyên t c: m t s vi sinh v t t ng h p đ c enzyme desulfohydrase xúc tác s chuy n hoá trong đi u ki n k khí các acid amin ch a l u hu nh nh
cysteine, cystin, methione và phóng H2S. Thành viên quan tr ng nh t c a nhóm enzyme này là cysteine desylfohydrase. Các acid amin này là s n ph m c a quá trình thu phân protein thành acid amin. Khí H2S sinh ra s t o t a mƠu đen v i ch th sulfide ch a trong môi tr ng ni c y. Ngồi ngu n đ m h u c , H2S cịn có th đ c t o ra do ph n ng kh thiosulfate Na2S2O3 b i enzyme thiosulfate reductase c a vi sinh v t đ t o ra sulfite và H2S.
Các h p ch t đ c s d ng trong môi tr ng làm ch th H2S có th là các h p ch t c a s t nh FeSO4, ammonium sulfate s t II ho c III. Khí H2S ph n ng v i ion s t s t o thành sulfide s t FeS khơng tan có mƠu đen. NgoƠi ra, acetate chì
Pb(C2H3O2) c ng có th đ c dùng làm ch th c a sulfide do h p ch t nƠy c ng
ph n ng v i H2S t o sulfide chì PbS khơng tan mƠu đen. Ch th acetate chì có đ
nh y cao cho phép phát hi n l ng nh H2S đ c t o ra nh ng loài vi khu n khơng thu c h Enterobacteriaceae, ví d nh Brucella.
Th nghi m kh n ng sinh H2S th ng đ c dùng đ phân bi t m t s loài thu c h Enterobacteriaceae nh Proteus.
Th nghi m kh n ng di đ ng
Nguyên t c: nh m xác đnh vi sinh v t có di đ ng hay không. Vi sinh v t di
đ ng th ng có tiên mao. Vi sinh v t di đ ng có th có m t hay nhi u tiên mao có
th phân b t i các v trí khác nhau trên t bào vi sinh v t.
Klebsiella pneumoniae khơng có tiên mao nên khơng có kh n ng di đ ng,
trên môi tr ng th ch vi khu n ch m c theo đ ng c y, ng c l i v i
Pseudomonas aeruginosa có tiên mao đ n c c do đó chúng m c lan ra kh i đ ng c y.
Th nghi m Citrate
M c đích: h ng d n k thu t th c hi n th nghi m citrate. Citrate là m t
trong nh ng th nghi m dùng phân bi t các nhóm lồi vi khu n: Klebsiella (+), Enterobacter (+) v i Escherichia (ậ) ho c đ phân bi t Edwardsiella (ậ) v i Salmonella (+)
Nguyên lý: m t s vi khu n có kh n ng s d ng citrate làm ngu n carbon duy nh t đ thu l y n ng l ng và v t ch t. S bi n d ng citrate th ng thông qua s k t h p v i acetyl coA thƠnh oxaloacetate đ vào chu trình Kreb. S bi n d ng
citrate thay đ i tu theo pH c a môi tr ng. khi pH t ng môi tr ng chuy n sang
ki m l ng acetate và format t o thành s t ng trong khi lactose vƠ CO2 gi m. pH trung tính s n ph m ch y u là CO2 và acetate. pH acid s n ph m t o ra ch y u
lƠ acetoin vƠ lactate. Nh v y s bi n d ng citrate b i vi khu n t o ra CO2 làm
ki m hố mơi tr ng. M t khác các vi khu n có kh n ng sinh citrate lƠm ngu n
carbon duy nh t đ u có kh n ng dùng mu i amonium làm ngu n đ m duy nh t. S phân gi i mu i amonium trong môi tr ng s sinh NH3 làm ki m hố mơi tr ng.
Nh v y trong môi tr ng th nghi m kh n ng s d ng làm ngu n carbon
duy nh t có ch a đ m d ng amonium, kh n ng t ng tr ng c a vi khu n s th hi n qua kh n ng bi n d ng ngu n carbon citrate và ngu n đ m amonium làm
t ng giá tr pH c a môi tr ng. s gia t ng giá tr pH nƠy đ c ch th b ng s thay
đ i màu c a ch th pH trong môi tr ng.
Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa có enzyme citrate permease có kh n ng bi n d ng citrate làm ngu n carbon t o NH3 làm ki m hố
mơi tr ng, ch th màu bromothymol blue trong môi tr ng ki m t màu l c chuy n thành xanh d ng.
Th nghi m decarboxylase [7]
Nguyên t c: các lo i vi khu n đ ng ru t khác nhau trong m c đ c m ng t o thành các enzyme carboxylase có vai trị xúc tác lo i b nhóm carboxyl m t s acid amin t o ra amine ho c diamine và CO2 trong đi u ki n k khí. Các enzyme này ch đ c c m ng t ng h p khi môi tr ng có tính acid và ch a ch t c m ng
đ c hi u. H decarboxylase g m nhi u thành viên, m i lo i ch tác đ ng lên m t c
ch t nh t đnh. Có 3 lo i decarboxylase quan tr ng trong ki m nghi m vi sinh v t là lysine decarboxylase (LDC), ornithine decarboxylase (ODC) và arginine
decarboxylase (ADC) có c ch t t ng t là lysine, ornithine và arginine. Ph n ng
đ c xúc tác b i LDC s lo i b CO2 ra kh i lysine, phóng thích CO2 và d n đ n s t o thành cadaverine. Tr ng h p ODC và ADC s n ph m t o ra là CO2 và putrescine. Ngồi ra, arginine cịn có th đ c chuy n hoá thành citruline nh xúc tác c a enzyme arginine dihydrolase (ADH) tr c khi đ c chuy n hoá ti p thành putrescine và CO2. Do v y th nghi m arginine decarboxylase (ADC) c ng đ c kí hi u là ADH. Trong t t c các tr ng h p nêu trên, CO2 sinh ra lƠm t ng pH c a
môi tr ng vƠ đ c ghi nh n qua s đ i màu c a ch th pH.
Các th nghi m decarboxylase th ng đ c dùng đ phân lo i vƠ đ nh danh các loài vi khu n đ ng ru t h Enterobacteriaceae.
Klebsiella pneumoniae có enzyme lysine decarboxylase thu phân lysine phóng thích CO2 và d n đ n s t o thành cadaverine, CO2 sinh ra lƠm t ng pH c a
môi tr ng vƠ đ c ghi nh n qua s đ i màu c a ch th màu.
Th nghi m urease
Nguyên t c: m t s vi sinh v t t ng h p enzyme urease xúc tác s thu phân c a urea. Urea (NH)2CO là diamide c a acid carbonic. Urease thu c nhóm các amidase xúc tác s thu phân c a liên k t amide gi a C ậ N trong phân t urea đ
gi i phóng hai phân t NH3 và CO2. Enzyme này ho t đ ng t i u pH 7,0, thu c nhóm enzyme c u trúc, hi n di n th ng xuyên trong t bào không ph thu c vào
s hi n di n hay không c a c ch t là urea. S phóng thích NH3 và CO2 lƠm t ng
pH c a mơi tr ng và có th đ c theo dõi qua s đ i màu c a ch t ch th pH.
Th nghi m urease lƠ đ c tr ng cho các loƠi Proteus spp. vƠ th ng dùng đ
phân bi t các d ng Proteus v i các thành viên khác c a Enterobacteriaceae.
Klebsiella pneumoniae t ng h p enzyme urease xúc tác s thu phân c a urea, gi i phóng hai phân t NH3 và CO2 lƠm t ng pH môi tr ng v i ch th màu phenol red làm chuy n mƠu môi tr ng sang h ng cánh sen.
Th nghi m kh n ng sinh Indol.
Nguyên t c: tryptophan là m t acid amin có th b oxy hố b i m t s vi sinh v t có h enzyme tryptophanase t o ra các s n ph m ch a g c Indol. S n ph m trung gian chính c a ph n ng oxi hoá tryptophan là indolpyruvic acid IPA. Phân t
nƠy sau đó b bi n đ i theo h ng lo i nhóm amin (deamination) thành indol hay
theo h ng lo i nhóm carboxyl (decarboxylation) thành skatol. Tryptophanase xúc
tác ph n ng lo i nhóm amin đ t o thành indol. Vi c phát hi n indol đ c th c hi n b ng ph n ng c a phân t này v i các thu c th ch a p ậ
Dimethylaminobenzaldehyd (p ậ DMABA). Nhân pyrol c a indol ch a nhóm CH2 s k t h p v i nhân benzene c a p ậ DMABA t o nên m t ph c ch t d ng quinone
có mƠu đ .
B ng 2.3. K t qu th nghi m sinh hoá: Klebsiella pneumoniae
Th nghi m KIA Manitol Citrate ADH LDC ODC Urea Indol L G H2S Gas Man Di đ ng
+ + - + + - + - + - + -
B ng 2.4. K t qu th nghi m sinh hoá: Pseudomonas aeruginosa
Th nghi m KIA Manitol Citrate ADH LDC ODC Urea Indol L G H2S Gas Man Di đ ng
- - - - - + + - - - - -
Pseudomonas aeruginosa có tiên mao đ n c c nên có kh n ng di đ ng.
trong môi tr ng th ch manitol vi khu n m c lan kh i đ ng c y. Th nghi m
Oxidase (+), l a c y có mùi th m đ c tr ng. Môi tr ng nuôi c y đ th nghi m
kháng sinh đ có màu xanh.
2.4 TH NGHI M KHỄNG SINH
2.4.1 Môi tr ng và sinh ph m
Mơi tr ng MHA
M c đích: th c hi n th nghi m kháng sinh đ nh m đánh giá tính nh y
c m v i kháng sinh c a vi khu n gây b nh đ giúp các th y thu c s d ng kháng sinh phù h p đ ch a tr cho b nh nhơn. ng th i đánh giá
tình hình kháng thu c c a vi khu n đ đ a ra các bi n pháp kh ng ch tình hình lây lan các ch ng vi khu n kháng thu c.
Nguyên t c: kháng sinh đ c t m s n vƠo các đ a gi y v i n ng đ thích h p s khu ch tán trên m t th ch có ch a vi khu n th nghi m. ng kính vịng vơ khu n giúp ta bi t đ c tính nh y c m c a vi khu n đ i v i
lo i kháng sinh đó.
2.4.2 Ph ng pháp th c hi n (theo ph ng pháp Kirby Bauer)
B c 1: Ghi thông tin c a ch ng vi khu n đ c phân l p t m u b nh ph m
lên đ a môi tr ng MHA vƠ tube n c mu i sinh lý.
B c 2: Pha huy n d ch vi khu n: dùng pipet Pasteur l y khóm trung hồ vào ng n c mu i trên. Vortex th t k cho vi khu n phơn tán đ u. So sánh v i đ đ c chu n 0,5 Mc Facland, sau đó pha loƣng đ có đ c huy n d ch t bào vi khu n
đ t m t đ 106 CFU/ mL.
B c 3: Láng huy n d ch vi khu n v a đ c pha loƣng lên môi tr ng
2.4.3 Ph ng pháp th nghi m kh n ng sinh ESBL
2.4.3.1 Ph ng pháp đ a đôi (double– disk diffusion test) [20][22]
ậ lactamase inhibitor (clavulanic acid, sulbactamsầ) c ch ESBL nên
làm gi m m c đ đ kháng c a cephalosporins và m r ng vịng vơ khu n c a đ a
kháng sinh cephalosporin th h 3 khi đ t g n m t đ a kháng sinh ch a ậ
lactamase inhibitor.
Cách th c hi n: đa amoxicillin/ clavulanate (20 µg/ 10 µg) đ c đ t trên trung tâm m t th ch MHA (đƣ c y ch ng vi khu n thu n khi t), các đ a
cephalosporin (30 µm) đ c đ t xung quanh cách nhau 20 mm vƠ đ t m 35oC/ 24 gi . Khi có s m r ng vịng vơ khu n c a đ a cephalosporin v phía ti p giáp
v i đ a clavulanate, ch ng t vi khu n đó đƣ sinh ESBL.
2.4.3.2 Ph ng pháp đ a k t h p (combination dics)
D a trên tính hi p l c c a đ a kháng sinh cephalosporin th h 3 so v i đ a
kháng sinh cephalosporin th h 3/ ậ lactamase inhibitor.
M t s vi khu n sinh AmpC, là m t ậ lactamase nh ng không lƠ ESBL
c ng xu t hi n gia t ng đ ng kính vịng vơ khu n khi có s hi n di n c a
clavulanic acid, vƠ gơy d ng tính gi .
Cách th c hi n: đa kháng sinh ch ch a m t lo i kháng sinh trong h cephalosporin (ceftazidime, cefotaxime, 30µg) và m t đ a ph i h p ceftazidime / clavulanate, cefotaxime/ clavulanate. ESBL (+) khi có s chênh l ch đ ng kính vịng vơ khu n ≥ 5 mm v i đ a t ng ng khơng có clavulanate.
Hình 2.15. Kh n ng sinh men ES c a vi khu n K. pneumoniae theo 2 ph ng pháp
Bên c nh vi c th nghi m kh n ng sinh enzyme ESBL, s sinh men ậ
lactamase type AmpC ngày càng ph bi n dù tr c đó các nghiên c u cho th y gen sinh men ậ lactamase type AmpC là r t ít. Vi c đ t các đ a kháng sinh nh m phát hi n kh n ng sinh enzyme ESBL c ng đ ng th i phát hi n kh n ng sinh enzyme
ậ lactamase type AmpC, ph ng pháp ki m tra kh n ng sinh enzyme ậ
lactamase type AmpC b ng cách s d ng các cephalosporines th h th 3 khác nhau và cefoxitin, vi khu n đ i kháng v i cefoxitin và gi m nh y c m v i cephalosporines th h th 3. [17][26]
2.4.3.3 Ph ng pháp thu nh n và x lý s li u
Thu th p s li u t ng ngày, ghi nh n và t ng h p nh ng thông tin c n thi t. X lý s li u theo ph ng pháp th ng kê, x d ng ph n m m Microsoft Excel xây d ng các bi u đ có liên quan.
Ph ng pháp
k t h p
Ph ng pháp đ a đôi
CH NG 3. K T QU VÀ TH O LU N TH O LU N
3.1 T L PHÂN L P NH DANH KLEBSIELLA PNEUMONIAE VÀ PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG
M U B NH PH M HỌ H P D I
Trong th i gian t tháng 11 n m 2013 đ n tháng 04 n m 2014 theo th ng kê khoa Vi sinh nh n đ c t ng s là 3052 m u b nh ph m t đ ng hô h p d i.
trong đó có 1206 m u d ng tính chi m 39,52% cịn 60,48% là nh ng m u đ c
xác đ nh là khơng có vi trùng gây b nh và m t ph n do nhi m t mơi tr ng bên
ngồi. T l đ c trình bày trong bi u đ 3.1.
Bi u đ 3.1. Bi u đ th hi n t l m u b nhi m vi khu n gây b nh t b nh ph m đ ng hô h p d i
Trong 1206 m u d ng tính, t l phân l p đ c các vi sinh v t trong m u b nh ph m t đ ng hơ h p d i có s khác nhau vƠ đ c trình bày b ng bên